Альцгеймерийн өвчин (AD) нь түүний олон эмгэг физиологийг тусгасан уургийн биомаркер дутагдаж, оношлогоо, эмчилгээний ахиц дэвшилд саад болдог. Энд бид МЭ-ийн эмгэг физиологийн өргөн хүрээг төлөөлдөг тархи нугасны шингэний (CSF) биомаркеруудыг тодорхойлохын тулд иж бүрэн протеомикийг ашигладаг. Мультиплекс масс спектрометр нь AD CSF болон тархинд ойролцоогоор 3500, ойролцоогоор 12000 уураг илрүүлсэн. Тархины протеомын сүлжээний шинжилгээ нь биологийн олон янз байдлын 44 модулийг шийдсэн бөгөөд тэдгээрийн 15 нь тархи нугасны шингэний протеомтой давхцаж байв. Эдгээр давхардсан модулиудын CSF AD маркерууд нь янз бүрийн эмгэг физиологийн процессуудыг төлөөлдөг таван уургийн бүлэгт хуваагддаг. МЭ-ийн тархи дахь синапс ба метаболитууд буурч, харин CSF нэмэгдэж, харин тархи болон CSF дахь глиалаар баялаг миелинжилт, дархлааны бүлгүүд нэмэгддэг. Самбарын өөрчлөлтийн тууштай байдал, өвчний өвөрмөц байдлыг 500 гаруй нэмэлт CSF дээжээр баталгаажуулсан. Эдгээр бүлгүүд мөн шинж тэмдэггүй МЭ-ийн биологийн дэд бүлгүүдийг тодорхойлсон. Ерөнхийдөө эдгээр үр дүн нь МЭ-ийн эмнэлзүйн хэрэглээнд зориулсан вэб дээр суурилсан биомаркер хэрэгсэлд чиглэсэн ирээдүйтэй алхам юм.
Альцгеймерийн өвчин (AD) нь дэлхий даяар мэдрэлийн доройтлын дементийн хамгийн түгээмэл шалтгаан бөгөөд синаптик дамжуулалт, глиалаар дамждаг дархлаа, митохондрийн бодисын солилцоо зэрэг олон төрлийн биологийн системийн үйл ажиллагааны доголдолоор тодорхойлогддог (1-3). Гэсэн хэдий ч түүний тогтсон уургийн биомаркерууд нь амилоид ба тау уураг илрүүлэхэд чиглэгддэг тул энэ олон янзын эмгэг физиологийг тусгаж чадахгүй байна. Тархи нугасны шингэнд (CSF) хамгийн найдвартай хэмжигдэх эдгээр "үндсэн" уургийн биомаркерууд нь (i) кортикал амилоид товруу үүсэхийг илэрхийлдэг амилоид бета пептид 1-42 (Aβ1-42); (ii) аксоны доройтлын шинж тэмдэг болох нийт tau; (iii) phospho-tau (p-tau), эмгэг судлалын гиперфосфоризацийн төлөөлөгч (4-7). Хэдийгээр эдгээр тархи нугасны шингэний биомаркерууд нь бидний "тэмдэглэгдсэн" AD уургийн өвчнийг (4-7) илрүүлэхэд ихээхэн тус дөхөм болсон боловч эдгээр нь өвчний цаадах нарийн төвөгтэй биологийн өчүүхэн хэсгийг л төлөөлдөг.
МЭ-ийн биомаркеруудын эмгэг физиологийн олон янз байдал дутагдалтай байгаа нь (i) МЭ-тэй өвчтөнүүдийн биологийн нэг төрлийн бус байдлыг тодорхойлох, тоон үзүүлэлтийг гаргах боломжгүй, (ii) өвчний хүнд байдал, явц, ялангуяа эмнэлзүйн өмнөх үе шатанд хангалтгүй хэмжигдэх зэрэг олон бэрхшээлийг дагуулж байна. iii) мэдрэлийн доройтлын бүх асуудлыг бүрэн шийдэж чадаагүй эмчилгээний эмийг хөгжүүлэх. Холбогдох өвчнөөс МЭ-ийг тайлбарлахын тулд бидний тэмдэглэсэн эмгэг судлалд найдах нь эдгээр асуудлыг улам хурцатгаж байна. Дементиа өвчтэй ихэнх ахмад настнуудад танин мэдэхүйн бууралтын нэгээс олон эмгэг шинж тэмдэг илэрч байгааг улам олон нотолгоо харуулж байна (8). МЭ-ийн эмгэг бүхий хүмүүсийн 90% ба түүнээс дээш хувь нь судасны өвчин, TDP-43 хольц эсвэл бусад дегенератив өвчинтэй байдаг (9). Эмгэг судлалын эдгээр давхцлын өндөр хувь нь бидний оюун ухааны хомсдолын оношлогооны тогтолцоог тасалдуулж байгаа тул өвчний илүү дэлгэрэнгүй эмгэг физиологийн тодорхойлолт шаардлагатай байна.
МЭ-ийн төрөл бүрийн биомаркеруудын яаралтай хэрэгцээг харгалзан энэ салбар биомаркеруудыг илрүүлэх ерөнхий системд суурилсан "омикс" аргыг улам бүр хэрэглэж байна. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance нь 2014 онд байгуулагдсан бөгөөд хөтөлбөрийн тэргүүн эгнээнд явж байна. Үндэсний эрүүл мэндийн хүрээлэн, академи, үйлдвэрлэлийн энэхүү олон талт хүчин чармайлт нь МЭ-ийн эмгэг физиологийг илүү сайн тодорхойлох, биологийн олон янз байдлын оношлогоо, эмчилгээний стратеги боловсруулахад системд суурилсан стратегийг ашиглах зорилготой юм (10). Энэхүү төслийн хүрээнд сүлжээний протеомик нь МЭ-д системд суурилсан биомаркеруудыг хөгжүүлэх ирээдүйтэй хэрэгсэл болсон. Энэхүү шударга бус өгөгдөлд тулгуурласан арга нь протеомикийн нарийн төвөгтэй өгөгдлийн багцыг тодорхой эсийн төрөл, органелл, биологийн үйл ажиллагаатай холбоотой хамтран илэрхийлэгдсэн уургийн "модуль" болгон зохион байгуулдаг (11-13). МЭ тархинд бараг 12 мэдээллээр баялаг сүлжээний протеомикийн судалгаа хийгдсэн (13-23). Ерөнхийдөө эдгээр дүн шинжилгээ нь МЭ-ийн тархины сүлжээний протеом нь бие даасан когорт болон олон кортикал бүсэд өндөр хадгалагдсан модульчлагдсан зохион байгуулалтыг хадгалж байгааг харуулж байна. Нэмж дурдахад эдгээр модулиудын зарим нь өгөгдлийн багц дахь AD-тэй холбоотой элбэг дэлбэг байдлын давтагдах өөрчлөлтийг харуулдаг бөгөөд энэ нь олон өвчний эмгэг физиологийг тусгасан байдаг. Хамтдаа эдгээр олдворууд нь МЭ-д системд суурилсан биомаркер болох тархины сүлжээний протеомыг нээх ирээдүйтэй зангуу цэгийг харуулж байна.
AD тархины сүлжээний протеомыг эмнэлзүйн хувьд ашигтай системд суурилсан биомаркер болгон хувиргахын тулд бид тархины гаралтай сүлжээг AD CSF-ийн протеомик шинжилгээтэй хослуулсан. Энэхүү нэгдсэн арга нь синапс, цусны судас, миелинжилт, үрэвсэл, бодисын солилцооны үйл ажиллагааны доголдол зэрэг тархинд суурилсан олон төрлийн эмгэг физиологитой холбоотой CSF биомаркерын ирээдүйтэй таван багцыг тодорхойлоход хүргэсэн. Бид эдгээр биомаркерын хавтанг олон тооны репликацын шинжилгээгээр амжилттай баталгаажуулсан бөгөөд үүнд янз бүрийн мэдрэлийн эмгэгийн 500 гаруй CSF дээжийг оруулав. Эдгээр баталгаажуулалтын шинжилгээнд шинж тэмдэггүй AD (AsymAD) бүхий өвчтөнүүдийн CSF-ийн бүлгийн зорилтот түвшинг шалгах эсвэл танин мэдэхүйн хэвийн орчинд хэвийн бус амилоид хуримтлалын нотолгоог харуулах зэрэг орно. Эдгээр дүн шинжилгээ нь AsymAD-ийн популяцид чухал биологийн ялгаатай байдлыг онцолж, өвчний хамгийн эхний үе шатанд хувь хүмүүсийг дэд хэвшүүлэх боломжтой самбар маркеруудыг тодорхойлдог. Ерөнхийдөө эдгээр үр дүн нь AD-д тулгардаг олон эмнэлзүйн сорилтуудыг амжилттай шийдэж чадах олон системд суурилсан уургийн биомаркерын хэрэгслийг хөгжүүлэх гол алхам юм.
Энэхүү судалгааны гол зорилго нь МЭ-д хүргэдэг тархинд суурилсан янз бүрийн эмгэг физиологийг тусгасан тархи нугасны шингэний шинэ биомаркеруудыг тодорхойлох явдал юм. Зураг S1 нь бидний судалгааны арга зүйг тоймлон харуулсан бөгөөд үүнд (i) AD CSF болон тархины сүлжээний протеомын урьдчилсан үр дүнд тулгуурласан цогц шинжилгээ, тархитай холбоотой олон тооны CSF өвчний биомаркерыг тодорхойлох, (ii) дараагийн хуулбарлах Эдгээр биомаркерууд хэд хэдэн бие даасан тархи нугасны хэсэгт байдаг. шингэний бүлэг. Нээлтэд чиглэсэн судалгаа нь Эмори Гойзуета Альцгеймерийн өвчин судлалын төвд (ADRC) танин мэдэхүйн хэвийн 20 хүн болон МЭ-ийн 20 өвчтөнд CSF-ийн дифференциал илэрхийлэлд дүн шинжилгээ хийх замаар эхэлсэн. Тархи нугасны шингэнд бага Aβ1-42, нийт tau болон p-tau-ийн түвшин ихэссэн тохиолдолд танин мэдэхүйн мэдэгдэхүйц гажиг гэж оношлогддог [Монреалийн танин мэдэхүйн дундаж үнэлгээ (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (Хүснэгт S1A). Хяналтад (MoCA дундаж, 26.7 ± 2.2) CSF биомаркерын түвшин хэвийн байна.
Хүний CSF нь уургийн элбэг дэлбэг байдлын динамик хүрээгээр тодорхойлогддог бөгөөд альбумин болон бусад маш их хэмжээний уураг нь сонирхож буй уургийг илрүүлэхээс сэргийлдэг (24). Уургийн нээлтийн гүнийг нэмэгдүүлэхийн тулд бид масс спектрометрийн (MS) шинжилгээ хийхээс өмнө CSF дээж бүрээс эхний 14 их хэмжээний уургийг устгасан (24). MS-ээр нийт 39,805 пептидийг тодорхойлсон бөгөөд тэдгээрийг 40 дээжинд 3691 протеомтой дүрсэлсэн байна. Уургийн хэмжээг тодорхойлохдоо олон тандем масс шошго (TMT) тэмдэглэгээ (18, 25) ашиглан гүйцэтгэдэг. Алга болсон өгөгдлийг арилгахын тулд бид зөвхөн дээжийн 50%-д нь тоон үзүүлэлттэй байсан уургуудыг дараагийн шинжилгээнд оруулсан бөгөөд эцэст нь 2875 протеомын тоо хэмжээг тодорхойлсон. Нийт уургийн элбэг дэлбэг байдлын түвшин мэдэгдэхүйц ялгаатай байсан тул хяналтын дээжийг статистикийн хувьд хэт давсан (13) гэж үзсэн бөгөөд дараагийн шинжилгээнд оруулаагүй болно. Үлдсэн 39 дээжийн элбэг дэлбэг утгыг нас, хүйс, багцын ковариацын дагуу тохируулсан (13-15, 17, 18, 20, 26).
Регрессийн өгөгдлийн багц дээрх дифференциал илэрхийллийг үнэлэхийн тулд статистикийн t-тестийн шинжилгээг ашиглан энэхүү шинжилгээ нь хяналтын болон AD тохиолдлын хооронд элбэг дэлбэг байдлын түвшин мэдэгдэхүйц өөрчлөгдсөн (P <0.05) уургуудыг тодорхойлсон (Хүснэгт S2A). Зураг 1А-д үзүүлснээр МЭ-ийн нийт 225 уургийн элбэг дэлбэг байдал мэдэгдэхүйц буурч, 303 уургийн элбэг дэлбэг байдал мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна. Эдгээр дифференциалаар илэрхийлэгдсэн уургууд нь өмнө нь тодорхойлсон тархи нугасны шингэний AD маркерууд, тухайлбал микротубултай холбоотой уураг tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), нейрофиламент (NEFL; P = 6.56 × 10−3), өсөлттэй холбоотой уураг 43 зэрэг орно. (GAP43; P = 1.46 × 10−5), тосны хүчлийг холбогч уураг 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), хитиназа 3 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), мэдрэлийн гранулин (NRGN; P = 3.43 × 10−4) ба VGF мэдрэлийн өсөлтийн хүчин зүйл (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Гэсэн хэдий ч бид ДНБ-ний диссоциацийн дарангуйлагч 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) болон SPARC-тай холбоотой модульчлагдсан кальцийн холболт 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) зэрэг бусад маш чухал зорилтуудыг тодорхойлсон. Генийн онтологийн (GO) шинжилгээгээр мэдэгдэхүйц буурсан 225 уургийн шинжилгээ нь стероидын солилцоо, цусны бүлэгнэлт, дааврын идэвхжил зэрэг биеийн шингэний үйл явцтай нягт холбоотой болохыг илрүүлсэн (Зураг 1B ба Хүснэгт S2B). Үүний эсрэгээр, 303-ийн мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн уураг нь эсийн бүтэц, энергийн солилцоотой нягт холбоотой байдаг.
(A) Галт уулын график нь хяналтын (CT) ба тэнхлэгийн хоорондох дифференциал илэрхийлэлийг илрүүлэхэд ашигладаг t-туршилтаар олж авсан -log10 статистик P утгатай (y-тэнхлэг) харьцуулахад log2 нугалах өөрчлөлтийг (x-тэнхлэг) харуулж байна. Бүх уургийн CSF протеомын AD тохиолдлууд. МЭ-ийн түвшин мэдэгдэхүйц буурсан уургийг (P <0.05) цэнхэр өнгөөр, харин өвчний түвшин мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн уургийг улаанаар харуулсан байна. Сонгосон уураг шошготой байна. (B) Уурагтай холбоотой дээд GO нэр томъёо нь МЭ-д мэдэгдэхүйц багассан (цэнхэр) болон нэмэгдсэн (улаан). Биологийн процесс, молекулын үйл ажиллагаа, эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн хамгийн өндөр z оноотой гурван GO нэр томъёог харуулав. (C) MS нь CSF дээж дэх MAPT түвшинг хэмжсэн (зүүн талд) болон түүний дээжийн ELISA tau түвшинтэй (баруун талд) хамаарлыг хэмжсэн. Холбогдох P утгатай Pearson корреляцийн коэффициентийг харуулав. МЭ-ийн нэг тохиолдлын хувьд ELISA-ийн өгөгдөл байхгүй тул эдгээр тоонд дүн шинжилгээ хийсэн 39 тохиолдлын 38-ын утгыг оруулсан болно. (D) Хяналт ба AD CSF дээрх хяналттай кластерийн шинжилгээ (P <0.0001, Бенжамин-Хочберг (BH) тохируулсан P <0.01) нь мэдээллийн багц дахь хамгийн их өөрчлөгдсөн 65 уураг ашигласан дээжийг олсон. Стандартчилах, хэвийн болгох.
MAPT-ийн протеомик түвшин нь бие даан хэмжигдсэн ELISA tau түвшинтэй нягт холбоотой (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Зураг 1C) нь бидний MS хэмжилтийн үнэн зөвийг дэмждэг. Амилоид прекурсор уургийн (APP) түвшинд трипсин задаргаа хийсний дараа Aβ1-40 ба Aβ1-42-ийн С төгсгөлд дүрслэгдсэн изоформын өвөрмөц пептидүүд үр дүнтэй иончлогдох боломжгүй (27, 28). Тиймээс бидний тодорхойлсон APP пептидүүд нь ELISA Aβ1-42 түвшинтэй ямар ч холбоогүй юм. Тохиолдол бүрийн дифференциал илэрхийлэлийг үнэлэхийн тулд бид дээжийн хяналттай кластерийн шинжилгээг хийхийн тулд P <0.0001 [хуурамч нээлтийн түвшин (FDR) залруулсан P <0.01] бүхий дифференциал илэрхийлсэн уураг ашигласан (Хүснэгт S2A). Зураг 1D-д үзүүлсэнчлэн эдгээр 65 чухал ач холбогдолтой уураг нь хяналтын шинж чанартай нэг МЭ тохиолдлоос бусад тохиолдолд өвчний төлөв байдлын дагуу дээжийг зөв цуглуулж чаддаг. Эдгээр 65 уургийн 63 нь МЭ-д өссөн бол зөвхөн хоёр (CD74 ба ISLR) буурсан байна. Нийтдээ эдгээр тархи нугасны шингэний шинжилгээ нь өвчний биомаркер болох олон зуун уураг илрүүлсэн.
Дараа нь бид МЭ тархины протеомын бие даасан сүлжээний шинжилгээ хийсэн. Энэхүү нээлтийн тархины бүлэгт хяналтаас (n = 10), Паркинсоны өвчин (PD; n = 10), холимог AD/PD (n = 10) болон AD (n = 10) тохиолдлуудаас нурууны урд талын бор гадаргын (DLPFC) багтсан. ) Дээж. Эмери Гойзуета ADRC. Эдгээр 40 тохиолдлын хүн ам зүйн мэдээллийг өмнө нь тайлбарласан (25) бөгөөд хүснэгт S1B-д нэгтгэн харуулав. Бид эдгээр 40 тархины эд, 27 тохиолдлын хуулбарлах бүлэгт дүн шинжилгээ хийхэд TMT-MS ашигласан. Нийтдээ эдгээр хоёр тархины өгөгдлийн багц нь 227,121 өвөрмөц пептид үйлдвэрлэсэн бөгөөд эдгээр нь 12,943 протеомтой (25) зурагдсан байна. Дараачийн судалгаанд зөвхөн тохиолдлын 50-иас доошгүй хувьд нь тоон үзүүлэлттэй байсан уурагуудыг оруулсан болно. Эцсийн нээлтийн өгөгдлийн багц нь 8817 тооны уураг агуулдаг. Нас, хүйс, үхлийн дараах интервал (PMI) дээр үндэслэн уургийн элбэг дэлбэг байдлын түвшинг тохируулна. Регрессийн дараа өгөгдлийн багцын дифференциал илэрхийллийн шинжилгээ нь хоёр ба түүнээс дээш өвчний бүлэгт 2000 гаруй уургийн түвшин мэдэгдэхүйц өөрчлөгдсөн болохыг харуулсан [P <0.05, дисперсийн шинжилгээ (ANOVA)]. Дараа нь бид дифференциалаар илэрхийлэгдсэн уургууд болон AD/хяналт ба/эсвэл AD/PD харьцуулалтад P<0.0001 (Зураг S2, A ба B, Хүснэгт S2C) дээр үндэслэн хяналттай кластерийн шинжилгээ хийсэн. Эдгээр 165 маш их өөрчлөгдсөн уураг нь хяналтын болон PD дээжээс МЭ-ийн эмгэг бүхий тохиолдлуудыг тодорхой харуулсан бөгөөд энэ нь бүхэлдээ протеомын AD-ийн өвөрмөц өөрчлөлтийг баталж байна.
Дараа нь бид Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) хэмээх алгоритмыг ашиглан илрүүлсэн тархины протеом дээр сүлжээний шинжилгээ хийхдээ өгөгдлийг ижил төстэй илэрхийллийн загвартай уургийн модулиуд болгон зохион байгуулав (11-13). Шинжилгээгээр 44 модулийг (M) хамт илэрхийлсэн уургуудыг тодорхойлж, хамгийн том (M1, n = 1821 уураг) -аас хамгийн жижиг (M44, n = 34 уураг) хүртэл ангилж, дугаарласан (Зураг 2А ба Хүснэгт S2D) ). Дээр дурьдсанчлан (13) Модуль тус бүрийн төлөөллийн илэрхийлэлийн профайл эсвэл онцлог уургийг тооцоолж, өвчний байдал, AD-ийн эмгэгтэй уялдуулах, өөрөөр хэлбэл Альцгеймерийн өвчний бүртгэл (CERAD) болон Бракийн онооны холбоог тогтоо (Зураг 2Б). Ерөнхийдөө 17 модуль нь МЭ-ийн невропатологитой ихээхэн холбоотой байв (P <0.05). Өвчинтэй холбоотой эдгээр модулиудын ихэнх нь эсийн төрөлд хамаарах маркераар баялаг байдаг (Зураг 2B). Дээр дурдсанчлан (13) эсийн төрлийн баяжуулалтыг модулийн давхцал болон эсийн төрөлд хамаарах генийн лавлагааны жагсаалтад дүн шинжилгээ хийх замаар тодорхойлно. Эдгээр генүүд нь тусгаарлагдсан хулганы мэдрэлийн эсүүд, эндотелийн болон глиал эсүүдийн нийтлэгдсэн мэдээллээс гаралтай. РНХ-ийн дараалал (RNA-seq) туршилт (29).
(A) Тархины протеомын WGCNA-г олж мэдээрэй. (B) CERAD (Aβ товруу) болон Брак (тау орооцолдох) оноо зэрэг МЭ-ийн невропатологийн шинж чанартай (дээд талд) модульчлагдсан шинж тэмдгийн уургийн (модуляр уургийн илэрхийлэлийн эхний гол бүрэлдэхүүн хэсэг) хоёр жингийн дунд корреляцийн (BiCor) шинжилгээ. Эерэг (улаан) ба сөрөг (цэнхэр) хамаарлын эрчмийг хоёр өнгийн дулааны зургаар харуулсан ба одоор нь статистикийн ач холбогдлыг илтгэнэ (P <0.05). Уургийн модуль бүрийн эсийн төрлийн холбоог үнэлэхийн тулд Гипергеометрийн Фишерийн Яг Туршилтыг (FET) (доод талд) ашиглана уу. Улаан өнгийн сүүдэрлэх эрч хүч нь эсийн төрлийн баяжуулалтын түвшинг, од нь статистикийн ач холбогдлыг илэрхийлдэг (P <0.05). FET-ээс авсан P утгыг засахын тулд BH аргыг ашиглана. (C) Модульчлагдсан уургийн GO шинжилгээ. Модуль эсвэл холбогдох модулийн бүлэг бүрийн хувьд хамгийн нягт холбоотой биологийн процессуудыг харуулав. олиго, олигодендроцит.
Астроцит ба микроглиагаар баялаг таван модулийн багц (M30, M29, M18, M24, M5) нь МЭ-ийн невропатологитой хүчтэй эерэг хамаарлыг харуулсан (Зураг 2Б). Онтологийн шинжилгээ нь эдгээр глиал модулиудыг эсийн өсөлт, тархалт, дархлаатай холбодог (Зураг 2С ба Хүснэгт S2E). M8 ба M22 гэсэн хоёр нэмэлт глиаль модулиуд нь өвчний үед хүчтэй зохицуулалттай байдаг. M8 нь төрөлхийн дархлааны хариу урвалд гол үүрэг гүйцэтгэдэг дохионы каскад болох Толл шиг рецепторын замтай маш их холбоотой байдаг (30). Үүний зэрэгцээ M22 нь орчуулгын дараах өөрчлөлттэй нягт холбоотой байдаг. Олигодендроцитоор баялаг M2 нь AD-ийн эмгэгтэй хүчтэй эерэг хамаарал, нуклеозидын синтез, ДНХ-ийн репликацитай онтологийн холбоог харуулж байгаа нь өвчний үед эсийн өсөлтийг сайжруулж байгааг харуулж байна. Ерөнхийдөө эдгээр олдворууд нь бидний өмнө нь AD сүлжээний протеомд ажиглагдсан глиал модулиудын өсөлтийг дэмжиж байна (13, 17). Одоогийн байдлаар сүлжээн дэх AD-тай холбоотой олон глиал модулиуд нь хяналтын болон PD тохиолдлуудад бага илэрхийллийн түвшинг харуулж байгаа нь AD-д өндөр байдаг өвчний өвөрмөц байдлыг онцлон харуулж байна (Зураг S2C).
Манай сүлжээний протеомын дөрөвхөн модуль (M1, M3, M10, M32) нь МЭ-ийн эмгэгтэй хүчтэй сөрөг хамааралтай (P <0.05) (Зураг 2, В ба В). M1 ба M3 хоёулаа мэдрэлийн эсүүдээр баялаг байдаг. M1 нь синаптик дохиотой маш их холбоотой байдаг бол M3 нь митохондрийн үйл ажиллагаатай нягт холбоотой байдаг. M10 ба M32 эсийн төрлийн баяжуулалтын нотолгоо байхгүй байна. M32 нь M3 ба эсийн бодисын солилцооны хоорондын уялдаа холбоог тусгадаг бол M10 нь эсийн өсөлт ба микротубулын үйл ажиллагаатай маш их холбоотой байдаг. МЭ-тэй харьцуулахад бүх дөрвөн модулиуд нь хяналт ба PD-д нэмэгдэж, өвчний өвөрмөц AD өөрчлөлтийг өгдөг (Зураг S2C). Ерөнхийдөө эдгээр үр дүн нь бидний өмнө нь МЭ-д ажиглагдаж байсан нейроноор баялаг модулиудын элбэг дэлбэг байдал буурч байгааг дэмжиж байна (13, 17). Дүгнэж хэлэхэд, бидний олж илрүүлсэн тархины протеомын сүлжээний шинжилгээ нь бидний өмнөх олдворуудтай нийцэж буй МЭ-д тусгайлан өөрчилсөн модулиудыг гаргаж авсан.
МЭ нь шинж тэмдэггүй эрт үе шатанд (AsymAD) тодорхойлогддог бөгөөд энэ үе шатанд хүмүүсийн танин мэдэхүйн эмнэлзүйн бууралтгүйгээр амилоид хуримтлал илэрдэг (5, 31). Энэ шинж тэмдэггүй үе шат нь эрт илрүүлэх, хөндлөнгөөс оролцох чухал цонх юм. Бид өмнө нь бие даасан мэдээллийн багц дээр AsymAD болон AD тархины сүлжээний протеомын хүчтэй модульчлагдсан хадгалалтыг харуулсан (13, 17). Бидний олж илрүүлсэн тархины сүлжээ нь эдгээр өмнөх олдворуудтай нийцэж байгаа эсэхийг шалгахын тулд бид DLPFC-ийн 27 байгууллагын хуулбарласан мэдээллийн багц дахь 44 модулийн хадгалалтад дүн шинжилгээ хийсэн. Эдгээр байгууллагуудад хяналтын (n = 10), AsymAD (n = 8) болон AD (n = 9) тохиолдлууд багтдаг. Хяналтын болон AD дээжийг манай нээлтийн тархины когортын шинжилгээнд оруулсан (Хүснэгт S1B), харин AsymAD тохиолдлууд зөвхөн хуулбарлах бүлэгт өвөрмөц байсан. Эдгээр AsymAD тохиолдлууд нь Эмори Гойзуета ADRC тархины банкнаас ирсэн. Хэдийгээр нас барах үед танин мэдэхүйн чадвар хэвийн байсан ч амилоид түвшин хэвийн бус өндөр байсан (CERAD дундаж, 2.8±0.5) (Хүснэгт S1B).
Эдгээр 27 тархины эдэд TMT-MS шинжилгээ хийсний үр дүнд 11,244 протеомын тоон үзүүлэлт гарсан. Энэхүү эцсийн тоололд зөвхөн дээжийн 50-иас доошгүй хувьд тоологдсон уургууд орно. Энэхүү хуулбарласан өгөгдлийн багц нь бидний илрүүлсэн тархины шинжилгээнд илэрсэн 8817 уургийн 8638 (98.0%)-ийг агуулсан бөгөөд хяналтын болон AD бүлгийн хооронд 3000 орчим их өөрчлөгдсөн уургууд байна (P<0.05, дисперсийн шинжилгээ хийх Tukey-ийн хосолсон t тестийн дараа) ( Хүснэгт S2F). Эдгээр дифференциалаар илэрхийлэгдсэн уургуудын дотроос 910 нь AD болон тархины протеомын хяналтын тохиолдлуудын хооронд мэдэгдэхүйц түвшний өөрчлөлтийг харуулсан (P <0.05, ANOVA Tukey хосолсон t-тестийн дараа). Эдгээр 910 тэмдэгтүүд нь протеомуудын хоорондох өөрчлөлтийн чиглэлд ихээхэн нийцэж байгааг тэмдэглэх нь зүйтэй (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Зураг S3A). Өсөн нэмэгдэж буй уургуудын дотроос өгөгдлийн багц хоорондын хамгийн тогтвортой өөрчлөлттэй уургууд нь голчлон глиалаар баялаг M5 ба M18 модулиудын (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, GFAP) гишүүд юм. Багасгасан уургуудын дотроос хамгийн тогтвортой өөрчлөлтүүд нь бараг зөвхөн синапстай холбоотой M1 модулийн (NPTX2, VGF, RPH3A) гишүүд байв. Бид цаашлаад midkine (MDK), CD44, ялгарсан үрчлээстэй холбоотой уураг 1 (SFRP1) болон VGF-ийн МЭ-тэй холбоотой өөрчлөлтийг western blotting-ээр шалгасан (Зураг S3B). Модулийн хадгалалтын шинжилгээ нь тархины протеом дахь уургийн модулиудын 80 орчим хувь нь (34/44) хуулбарлах өгөгдлийн багцад мэдэгдэхүйц хадгалагдсан болохыг харуулсан (z-оноо> 1.96, FDR засварласан P <0.05) (Зураг S3C). Эдгээр модулиудын 14 нь хоёр протеомын хооронд тусгайлан хадгалагдсан (z-score> 10, FDR засварлагдсан P <1.0 × 10−23). Ерөнхийдөө тархины протеомын хоорондох дифференциал илэрхийлэл ба модульчлагдсан найрлагын өндөр түвшний уялдаа холбоог олж, хуулбарлах нь AD-ийн урд талын бор гадаргын уургийн өөрчлөлтийн нөхөн үржих чадварыг онцолж байна. Нэмж дурдахад AsymAD болон илүү дэвшилтэт өвчин нь тархины сүлжээний бүтэцтэй маш төстэй болохыг баталсан.
Тархины хуулбарлах өгөгдлийн багц дахь дифференциал илэрхийлэлд илүү нарийвчилсан дүн шинжилгээ хийх нь AsymAD болон хяналтын хооронд нийт 151 мэдэгдэхүйц өөрчлөгдсөн уураг зэрэг AsymAD уургийн өөрчлөлтийн мэдэгдэхүйц түвшинг онцолж байна (P <0.05) (Зураг S3D). Амилоид ачаалалтай уялдуулан AsymAD болон AD-ийн тархинд APP мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн. MAPT нь зөвхөн МЭ-д ихээхэн өөрчлөгддөг бөгөөд энэ нь орооцолдох түвшин нэмэгдэж, танин мэдэхүйн бууралттай холбоотой холбоотой байдаг (5, 7). Глиалаар баялаг модулиуд (M5 ба M18) нь AsymAD дахь уургийн өсөлтөд маш их тусгагдсан байдаг бол нейронтой холбоотой M1 модуль нь AsymAD дахь уургийн бууралтыг хамгийн их төлөөлдөг. Эдгээр AsymAD маркеруудын ихэнх нь шинж тэмдгийн өвчинд илүү их өөрчлөлтийг харуулдаг. Эдгээр маркеруудын дунд тархины хавдар, нүд, мөчний хөгжилтэй холбоотой M18 бүлэгт хамаарах глиал уураг болох SMOC1 байдаг (32). MDK нь M18-ийн өөр нэг гишүүн болох эсийн өсөлт ба ангиогенезтэй холбоотой гепариныг холбодог өсөлтийн хүчин зүйл юм (33). Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад AsymAD мэдэгдэхүйц нэмэгдэж, дараа нь AD ихэссэн. Үүний эсрэгээр, синаптик уураг нейропентраксин 2 (NPTX2) нь AsymAD тархинд мэдэгдэхүйц буурсан байна. NPTX2 нь өмнө нь мэдрэлийн доройтолтой холбоотой байсан бөгөөд өдөөх синапсуудыг зуучлах үүрэгтэй байдаг (34). Ерөнхийдөө эдгээр үр дүн нь МЭ-ийн янз бүрийн эмнэлзүйн өмнөх уургийн өөрчлөлтийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь өвчний хүнд явцтай зэрэгцэн хөгжиж байна.
Тархины протеомыг нээснээр бид уургийн хамрах хүрээг мэдэгдэхүйц гүнзгийрүүлсэн тул сүлжээний түвшний AD транскриптомтой давхцаж байгааг илүү бүрэн ойлгохыг хичээж байна. Тиймээс бид нээсэн тархины протеомыг AD (n = 308) болон хяналтын (n = 157) DLPFC эдэд (13) 18,204 генийн микроаррей хэмжилтээс өмнө үүсгэсэн модультай харьцуулсан. давхцах. Бид нийтдээ 20 өөр РНХ модулийг тодорхойлсон бөгөөд тэдгээрийн ихэнх нь нейрон, олигодендроцит, астроцит, микроглия зэрэг тодорхой төрлийн эсийн баяжуулалтыг харуулсан (Зураг 3А). AD-д эдгээр модулиудын олон өөрчлөлтийг Зураг 3B-д үзүүлэв. Гүн тэмдэглэгээгүй MS протеом (3000 орчим уураг) (13) ашиглан бидний өмнөх уураг-РНХ-ийн давхцлын шинжилгээтэй нийцүүлэн бидний олсон тархины протеомын сүлжээний 44 модулийн ихэнх нь транскриптомын сүлжээнд байдаг. Тархины протеомд их хэмжээгээр хадгалагддаг 34 уургийн модулийг бидний олж илрүүлж, хуулбарлахад зөвхөн 14 (~40%) нь Фишерийн нарийн тестийг (FET) давсан нь транскриптомтой статистикийн хувьд чухал давхцаж байсан нь батлагдсан (Зураг 3A). ДНХ-ийн гэмтлийг засах (P-M25 ба P-M19), уургийн орчуулга (P-M7 ба P-M20), РНХ холбох/холбох (P-M16 ба P-M21) болон уургийн зорилтот (P-M13 ба P-) зэрэгтэй нийцдэг. M23) нь транскриптом дахь модулиудтай давхцдаггүй. Тиймээс, одоогийн давхцлын шинжилгээнд (13) илүү гүнзгий протеомын өгөгдлийн багцыг ашиглаж байгаа боловч AD сүлжээний протеомын ихэнх хэсгийг транскриптомын сүлжээнд дүрсэлсэнгүй.
(A) Гипергеометрийн FET нь AD транскриптомын (дээд) РНХ модулийн эсийн төрлийн өвөрмөц тэмдэглэгээг баяжуулж, AD тархины РНХ (x тэнхлэг) ба уураг (y тэнхлэг) модулиудын давхцлын зэргийг харуулдаг. (доод). Улаан өнгийн сүүдэрлэх эрч хүч нь дээд самбар дахь эсийн төрлүүдийн баяжуулалтын зэрэг, доод самбар дахь модулиудын давхцлын эрчмийг илэрхийлдэг. Од тэмдэг нь статистикийн ач холбогдлыг илтгэнэ (P <0.05). (B) Транскриптомын модуль бүрийн онцлог ген ба AD төлөвийн хоорондын хамаарлын зэрэг. Зүүн талд байгаа модулиуд нь AD (цэнхэр), баруун талд байгаа модулиуд нь AD (улаан) -тай хамгийн эерэг хамааралтай байна. Лог-өөрчлөгдсөн BH-засварлагдсан P утга нь хамаарал бүрийн статистик ач холбогдлын зэргийг илэрхийлнэ. (C) Хамтарсан эсийн төрлийн баяжуулалт бүхий ихээхэн давхардсан модулиуд. (D) Давхардсан модуль дахь шошготой уураг (x тэнхлэг) ба РНХ (y тэнхлэг) -ийн лог2 дахин өөрчлөлтийн корреляцийн шинжилгээ. Холбогдох P утгатай Pearson корреляцийн коэффициентийг харуулав. Микро, микроглиа; селестиел биетүүд, астроцитууд. CT, хяналт.
Ихэнх давхцаж буй уураг ба РНХ модулиуд нь ижил төрлийн эсийн баяжуулалтын профайлыг хуваалцаж, AD-ийн тогтмол өөрчлөлтийн чиглэлийг хуваалцдаг (Зураг 3, В ба В). Өөрөөр хэлбэл, тархины протеомын (PM1) синапстай холбоотой M1 модулийг мэдрэлийн эсүүдээр баялаг гомолог РНХ-ийн гурван модульд (R-M1, R-M9 ба R-M16) дүрсэлсэн байдаг. буурсан түвшин. Үүний нэгэн адил глиалаар баялаг M5 ба M18 уургийн модулиуд нь астроцит болон микроглиал маркераар баялаг РНХ модулиудтай (R-M3, R-M7, R-M10) давхцаж, өвчин нэмэгдэхэд ихээхэн оролцдог. Эдгээр хоёр мэдээллийн багцын хооронд хуваалцсан модульчлагдсан шинж чанарууд нь бидний тархины протеомд ажиглагдсан эсийн төрлийн баяжуулалт болон өвчинтэй холбоотой өөрчлөлтүүдийг дэмждэг. Гэсэн хэдий ч бид эдгээр хуваалцсан модулиудын РНХ болон бие даасан маркеруудын уургийн түвшний хооронд олон мэдэгдэхүйц ялгааг ажигласан. Эдгээр давхцаж буй модулиудын доторх молекулуудын протеомик ба транскриптомикийн дифференциал илэрхийллийн корреляцийн шинжилгээ (Зураг 3D) нь энэхүү үл нийцлийг онцолж байна. Жишээлбэл, APP болон бусад хэд хэдэн глиал модулийн уургууд (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, SFRP1) нь AD протеомын мэдэгдэхүйц өсөлтийг харуулсан боловч AD транскриптомд бараг өөрчлөлт ороогүй байна. Эдгээр уургийн өвөрмөц өөрчлөлтүүд нь амилоид товруу (23, 35)-тай нягт холбоотой байж болох ба протеомыг эмгэг өөрчлөлтийн эх үүсвэр гэж тодотгож, эдгээр өөрчлөлтүүд нь транскриптомд тусгагдаагүй байж болно.
Бидний нээсэн тархи болон CSF протеомуудыг бие даан шинжилсний дараа бид тархины сүлжээний эмгэг физиологитой холбоотой AD CSF биомаркеруудыг тодорхойлохын тулд хоёр мэдээллийн багцад иж бүрэн дүн шинжилгээ хийсэн. Бид эхлээд хоёр протеомын давхцлыг тодорхойлох ёстой. Хэдийгээр CSF нь МЭ-ийн тархинд нейрохимийн өөрчлөлтийг тусгадаг (4) гэж нийтээр хүлээн зөвшөөрдөг боловч AD тархи болон CSF протеомын хооронд яг давхцах зэрэг нь тодорхойгүй байна. Бидний хоёр протеомоос илэрсэн хуваалцсан генийн бүтээгдэхүүний тоог харьцуулж үзвэл тархи нугасны шингэнд тодорхойлогдсон уургийн бараг 70% (n = 1936) нь тархинд мөн тодорхойлогддог болохыг олж мэдсэн (Зураг 4А). Эдгээр давхцаж буй уургийн ихэнх нь (n = 1721) нээлтийн тархины мэдээллийн багцаас 44 хамтарсан илэрхийллийн модулийн аль нэгэнд дүрслэгдсэн байдаг (Зураг 4B). Хүлээгдэж байсанчлан тархины зургаан том модуль (M1-ээс M6) хамгийн их хэмжээний CSF-ийн давхцлыг харуулсан. Гэсэн хэдий ч тархины модулиас хоёр дахин том хэмжээтэй, гэнэтийн өндөр давхцлыг бий болгодог жижиг тархины модулиуд (жишээлбэл, M15 ба M29) байдаг. Энэ нь тархи ба тархи нугасны шингэний давхцлыг тооцоолох илүү нарийвчилсан, статистикийн аргыг ашиглахад биднийг өдөөдөг.
(A ба B) Нээлтийн тархи болон CSF мэдээллийн багцад илэрсэн уурагууд давхцаж байна. Эдгээр давхцсан уургийн ихэнх нь тархины хамтын илэрхийлэлийн сүлжээний 44 хамтарсан илэрхийллийн модулийн аль нэгтэй холбоотой байдаг. (C) Тархи нугасны шингэний протеом ба тархины сүлжээний протеом хоорондын давхцлыг олж мэд. Дулааны зургийн мөр бүр нь гипергеометрийн FET-ийн бие даасан давхцлын шинжилгээг илэрхийлдэг. Дээд эгнээ нь тархины модуль болон бүхэл бүтэн CSF протеомын хоорондох давхцлыг (саарал/хар сүүдэр) дүрсэлдэг. Хоёрдахь мөрөнд тархины модулиуд болон CSF уураг (улаанаар сүүдэрлэсэн) хоорондын давхцал нь AD-д мэдэгдэхүйц нэмэгддэг болохыг харуулж байна (P <0.05). Гурав дахь эгнээ нь тархины модулиуд болон CSF уураг (цэнхэр сүүдэрлэх) хоорондын давхцал нь AD-д мэдэгдэхүйц буурдаг болохыг харуулж байна (P <0.05). FET-ээс авсан P утгыг засахын тулд BH аргыг ашиглана. (D) Нүдний төрлийн холбоо болон холбогдох GO нэр томъёонд суурилсан эвхдэг модулийн самбар. Эдгээр хавтангууд нь тархитай холбоотой нийт 271 уураг агуулдаг бөгөөд эдгээр нь CSF протеом дахь ялгаатай илэрхийлэл юм.
Нэг сүүлт FET-ийг ашиглан бид CSF протеом болон бие даасан тархины модулиудын хоорондох уургийн давхцлын ач холбогдлыг үнэлэв. Шинжилгээгээр CSF өгөгдлийн багц дахь нийт 14 тархины модулиуд статистикийн ач холбогдолтой давхцалтай (FDR тохируулсан P<0.05), нэмэлт модуль (M18) нь ач холбогдолтой (FDR тохируулсан P = 0.06) байгааг илрүүлсэн (Зураг 4C). , дээд эгнээ). Бид мөн дифференциалаар илэрхийлэгдсэн CSF уурагтай хүчтэй давхцдаг модулиудыг сонирхож байна. Тиймээс бид (i) CSF уургийн аль нь AD-д мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн, (ii) CSF уураг нь AD-д мэдэгдэхүйц буурсан болохыг тодорхойлохын тулд бид хоёр нэмэлт FET шинжилгээг ашигласан (P <0.05, хосолсон t тест AD/control) Тархины модулиудын утга учиртай давхцал. тэдний хооронд. Зураг 4С-ийн дунд ба доод эгнээнд үзүүлснээр эдгээр нэмэлт шинжилгээнүүд нь тархины 44 модулийн 8 нь AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, M38)-д нэмсэн уурагтай ихээхэн давхцаж байгааг харуулж байна. . ), зөвхөн хоёр модуль (M6 ба M15) нь AD CSF-ийн бууруулсан уурагтай утга учиртай давхцаж байгааг харуулсан. Хүлээгдэж буйгаар бүх 10 модуль нь CSF протеомтой хамгийн их давхцдаг 15 модульд байна. Тиймээс эдгээр 15 модуль нь МЭ-ийн тархинаас гаралтай CSF биомаркеруудын өндөр үр ашигтай эх үүсвэр гэж бид үзэж байна.
Бид эдгээр 15 давхардсан модулийг WGCNA модны диаграмм дахь ойролцоо байдал, эсийн төрөл, генийн онтологитой холбоотой эсэх дээр үндэслэн таван том уургийн хавтан болгон нугалав (Зураг 4D). Эхний самбар нь нейроны маркерууд болон синапстай холбоотой уураг (M1 ба M12) -аар баялаг модулиудыг агуулдаг. Синаптик самбар нь нийт 94 уураг агуулдаг бөгөөд CSF протеом дахь түвшин ихээхэн өөрчлөгдсөн нь таван хавтангийн дунд тархитай холбоотой CSF маркеруудын хамгийн том эх үүсвэр болсон. Хоёрдахь бүлэг (M6 ба M15) нь "шархны эдгэрэлт" (M6), "хошин дархлааны зохицуулалт" (M15) гэх мэт эндотелийн эсийн маркерууд ба судасны биетэй нягт холбоотой болохыг харуулсан. M15 нь эндотелитэй нягт холбоотой липопротеины солилцоотой маш их холбоотой байдаг (36). Судасны самбар нь тархитай холбоотой 34 CSF тэмдэглэгээг агуулдаг. Гурав дахь бүлэгт олигодендроцит маркер болон эсийн өсөлттэй ихээхэн холбоотой модулиуд (M2 ба M4) орно. Жишээлбэл, М2-ийн дээд түвшний онтологийн нэр томъёонд "ДНХ-ийн репликацийн эерэг зохицуулалт", "пурины биосинтезийн үйл явц" орно. Үүний зэрэгцээ, M4-д "глиал эсийн ялгарал" ба "хромосомын тусгаарлалт" орно. Миелинжуулалтын самбар нь тархитай холбоотой 49 CSF тэмдэглэгээг агуулдаг.
Дөрөвдүгээр бүлэгт хамгийн олон модуль (M30, M29, M18, M24, M5) багтдаг бөгөөд бараг бүх модулиуд нь микроглиа болон астроцит маркераар ихээхэн баялаг юм. Миелинжуулалтын самбартай адил дөрөв дэх самбар нь эсийн өсөлттэй нягт холбоотой модулиудыг (M30, M29, M18) агуулдаг. Энэ бүлгийн бусад модулиуд нь "дархлааны үйл явц" (M5) болон "дархлааны хариу урвалын зохицуулалт" (M24) зэрэг дархлаа судлалын нэр томьёотой маш их холбоотой байдаг. Глиал дархлааны бүлэг нь тархитай холбоотой 42 CSF тэмдэглэгээг агуулдаг. Эцэст нь, сүүлчийн самбарт дөрвөн модуль (M44, M3, M33, M38) дээр тархитай холбоотой 52 маркер багтсан бөгөөд эдгээр нь бүгд бие махбодид энерги хадгалах, бодисын солилцоотой холбоотой байдаг. Эдгээр модулиудын хамгийн том нь (M3) нь митохондритай нягт холбоотой бөгөөд нейроны өвөрмөц маркераар баялаг юм. M38 нь энэ метаболомын жижиг модулийн гишүүдийн нэг бөгөөд дунд зэргийн нейроны өвөрмөц байдлыг харуулдаг.
Ерөнхийдөө эдгээр таван самбар нь МЭ-ийн бор гадаргын өргөн хүрээний эсийн төрөл, функцийг тусгасан бөгөөд тархитай холбоотой 271 CSF тэмдэглэгээг агуулдаг (Хүснэгт S2G). Эдгээр MS-ийн үр дүнгийн үнэн зөвийг үнэлэхийн тулд бид олон талт чадвар, өндөр мэдрэмж, өвөрмөц чанар бүхий ортогональ эсрэгбие дээр суурилсан ойрын өргөтгөлийн шинжилгээг (PEA) ашигласан бөгөөд тархи нугасны шингэний дээжийг дахин шинжилж, эдгээр 271 биомаркерын дэд хэсгийг олсон. (n = 36). Эдгээр 36 зорилтууд нь бидний MS-д суурилсан үр дүнтэй (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) нягт холбоотой PEA-ийн AD-ийн олон тооны өөрчлөлтийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь бидний MS-ийн цогц шинжилгээний үр дүнг баттай нотолсон (Зураг S4). ).
Синаптик дохиололоос эхлээд энергийн солилцоо хүртэл манай таван бүлгийн онцолсон биологийн сэдвүүд бүгд МЭ-ийн эмгэг жамтай холбоотой (1-3). Тиймээс эдгээр хавтанг агуулсан бүх 15 модуль нь бидний олж илрүүлсэн тархины протеом дахь МЭ-ийн эмгэгтэй холбоотой юм (Зураг 2B). Хамгийн алдартай нь манай глиаль модулиудын хоорондох өндөр эерэг эмгэгийн хамаарал ба бидний хамгийн том мэдрэлийн модулиуд (M1 ба M3) хоорондын хүчтэй сөрөг эмгэгийн хамаарал юм. Бидний хуулбарласан тархины протеомын дифференциал экспрессийн шинжилгээ (Зураг S3D) нь M5 ба M18-аас гаралтай глиал уургийг онцолж өгдөг. AsymAD болон шинж тэмдгийн AD-д хамгийн их хэмжээгээр нэмэгддэг glial уураг ба M1-тэй холбоотой синапсууд Уураг хамгийн ихээр буурдаг. Эдгээр ажиглалтууд нь бидний таван бүлэгт тодорхойлсон тархи нугасны шингэний 271 маркер нь МЭ-ийн бор гадаргын өвчний үйл явц, тэр дундаа шинж тэмдэггүй эхний үе шатанд тохиолддог өвчинтэй холбоотой болохыг харуулж байна.
Тархи болон нугасны шингэн дэх самбарын уургийн өөрчлөлтийн чиглэлийг илүү сайн шинжлэхийн тулд бид давхцаж буй 15 модулийн хувьд дараахь зүйлийг зурсан: (i) тархины өгөгдлийн багц дахь модулийн элбэг байдлын түвшинг олж, (ii) модуль уураг Энэ ялгаа нь тархи нугасны шингэнд илэрхийлэгддэг (Зураг S5). Өмнө дурьдсанчлан, WGCNA нь тархины модулийн элбэг дэлбэг байдал эсвэл уургийн шинж чанарыг тодорхойлоход хэрэглэгддэг (13). Галт уулын зураглалыг тархи нугасны шингэн дэх модуль уургийн ялгавартай илэрхийлэлийг тодорхойлоход ашигладаг (AD/control). Эдгээр тоонууд нь таван самбарын гурав нь тархи, нугасны шингэний илэрхийлэлийн өөр өөр хандлагыг харуулж байгааг харуулж байна. Синапсын самбарын хоёр модуль (M1 ба M12) нь МЭ-ийн тархинд элбэг дэлбэг байдлын түвшин буурч байгааг харуулж байгаа боловч AD CSF дахь уураг ихэссэнтэй ихээхэн давхцаж байна (Зураг S5A). Метаболом (M3 ба M38) агуулсан нейронтой холбоотой модулиуд нь ижил төстэй тархи, тархи нугасны шингэний илэрхийлэлийн хэлбэрүүд хоорондоо нийцэхгүй байгааг харуулсан (Зураг S5E). Судасны самбар нь янз бүрийн илэрхийллийн чиг хандлагыг харуулсан боловч түүний модулиуд (M6 ба M15) МЭ-ийн тархинд дунд зэрэг нэмэгдэж, өвчтэй CSF-д буурсан байна (Зураг S5B). Үлдсэн хоёр хавтан нь том глиал сүлжээг агуулдаг бөгөөд тэдгээрийн уураг нь хоёр тасалгаанд тогтмол зохицуулалттай байдаг (Зураг S5, C, D).
Эдгээр чиг хандлага нь эдгээр самбар дээрх бүх тэмдэглэгээнд нийтлэг биш гэдгийг анхаарна уу. Жишээлбэл, синаптик самбар нь AD тархи болон CSF-д мэдэгдэхүйц буурдаг хэд хэдэн уураг агуулдаг (Зураг S5A). Эдгээр доош зохицуулалттай тархи нугасны шингэний маркеруудын дунд NPTX2 ба M1-ийн VGF, M12-ийн хромогранин В байдаг. Гэсэн хэдий ч эдгээр үл хамаарах зүйлүүдээс үл хамааран бидний ихэнх синаптик маркерууд AD нугасны шингэнд ихэсдэг. Ерөнхийдөө эдгээр дүн шинжилгээ нь бидний таван самбар тус бүрийн тархи болон тархи нугасны шингэний түвшний статистикийн ач холбогдолтой хандлагыг ялгаж чадсан. Эдгээр чиг хандлага нь МЭ-ийн тархи ба CSF уургийн илэрхийлэл хоорондын нарийн төвөгтэй бөгөөд ихэвчлэн ялгаатай харилцааг онцлон тэмдэглэдэг.
Дараа нь бид 271 багц биомаркерыг хамгийн ирээдүйтэй, дахин үржих боломжтой зорилт болгон нарийсгахын тулд өндөр хүчин чадалтай MS хуулбарлах шинжилгээг (CSF replication 1) ашигласан (Зураг 5А). CSF хуулбар 1 нь Emory Goizueta ADRC-ийн хяналт, AsymAD, AD когорт зэрэг нийт 96 дээжийг агуулдаг (Хүснэгт S1A). Эдгээр МЭ-ийн тохиолдлууд нь танин мэдэхүйн бага зэргийн бууралтаар тодорхойлогддог (дундаж МХА, 20.0 ± 3.8), тархи нугасны шингэнд батлагдсан AD биомаркерын өөрчлөлтүүд (Хүснэгт S1A). Бидний олж мэдсэн CSF-ийн шинжилгээнээс ялгаатай нь энэ хуулбарыг илүү үр ашигтай, өндөр хүчин чадалтай "нэг удаагийн" MS аргыг (офлайнаар хуваахгүйгээр), түүний дотор дээж бэлтгэх хялбаршуулсан протоколыг ашиглан хийсэн бөгөөд энэ нь бие даасан дээжийг дархлаа сулруулах хэрэгцээг арилгадаг. . Үүний оронд дархлаа суларсан ганц "сайжруулах суваг" нь бага уургийн дохиог нэмэгдүүлэхэд ашиглагддаг (37). Хэдийгээр энэ нь протеомын нийт хамрах хүрээг багасгадаг ч энэ нэг удаагийн арга нь машины ажиллах хугацааг эрс багасгаж, амьдрах чадвартай шинжилж болох TMT шошготой дээжийн тоог нэмэгдүүлдэг (17, 38). Нийт дүн шинжилгээгээр 6,487 пептид илрүүлсэн бөгөөд 96 тохиолдлын 1,183 протеомтой зурагдсан байна. Бидний олж мэдсэн CSF-ийн шинжилгээний нэгэн адил зөвхөн дээжийн 50-иас доошгүй%-д нь хэмжигдэх уурагуудыг дараагийн тооцоололд оруулсан бөгөөд нас, хүйсийн нөлөөг харгалзан өгөгдлийг регресс болгосон. Энэ нь 792 протеомын эцсийн тоог гаргахад хүргэсэн бөгөөд тэдгээрийн 95% нь CSF мэдээллийн багцад мөн тодорхойлогдсон байна.
(A) Тархитай холбоотой CSF уургийн зорилтуудыг эхний хуулбарласан CSF когортоор баталгаажуулж, эцсийн самбарт оруулсан (n = 60). (B-ээс E) CSF хуулбарлах дөрвөн бүлэгт хэмжсэн самбар биомаркерын түвшин (нийлмэл z-оноо). Давталтын дүн шинжилгээ бүрийн элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлтийн статистикийн ач холбогдлыг үнэлэхийн тулд хосолсон t-тест эсвэл Tukey-ийн дараах залруулга бүхий ANOVA-г ашигласан. CT, хяналт.
Бид иж бүрэн дүн шинжилгээ хийх замаар тархитай холбоотой 271 CSF зорилтыг баталгаажуулахыг онцгой сонирхож байгаа тул бид энэхүү хуулбарласан протеомын цаашдын судалгааг эдгээр тэмдэглэгээгээр хязгаарлах болно. Эдгээр 271 уургийн дотроос 100 нь CSF репликаци 1-д илэрсэн. Зураг S6A нь хяналтын болон AD репликацийн дээжийн хоорондох эдгээр 100 давхцаж буй маркеруудын ялгавартай илэрхийллийг харуулж байна. Өвчний үед синаптик ба метаболит гистонууд хамгийн их нэмэгддэг бол судасны уураг хамгийн их буурдаг. Давхардсан 100 тэмдэглэгээний ихэнх нь (n = 70) хоёр өгөгдлийн багц дахь өөрчлөлтийн ижил чиглэлийг хадгалсан (Зураг S6B). Тархитай холбоотой эдгээр баталгаажсан 70 CSF маркер (Хүснэгт S2H) нь өмнө нь ажиглагдсан самбарын илэрхийлэлийн чиг хандлагыг голчлон тусгадаг, өөрөөр хэлбэл судасны уургийн бууралт, бусад бүх самбаруудын өсөлт зохицуулалт. Эдгээр баталгаажсан 70 уургийн зөвхөн 10 нь AD-ийн элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлтийг харуулсан нь эдгээр самбарын чиг хандлагатай зөрчилдөж байв. Тархи болон тархи нугасны шингэний ерөнхий чиг хандлагыг хамгийн сайн тусгасан самбарыг бий болгохын тулд бид эдгээр 10 уургийг эцэст нь баталгаажуулсан сонирхлын самбараас хассан (Зураг 5А). Тиймээс манай самбар эцэст нь өөр өөр дээж бэлтгэх болон MS платформын шинжилгээг ашиглан бие даасан CSF AD бүлэгт батлагдсан нийт 60 уургийг багтаасан болно. CSF хуулбар 1 хяналтын болон AD тохиолдлууд дахь эдгээр эцсийн самбаруудын z онооны илэрхийллийн графикууд нь бидний олсон CSF когортод ажиглагдсан самбарын чиг хандлагыг баталгаажуулсан (Зураг 5В).
Эдгээр 60 уургийн дунд олон судалгаагаар AD-тай холбоотой үрэвсэлт цитокин болох остеопонтин (SPP1) болон синаптик уураг болох GAP43 зэрэг МЭ-тэй холбоотой молекулууд байдаг. Энэ нь мэдрэлийн доройтолтой тодорхой холбоотой (42). Хамгийн бүрэн баталгаажсан уургууд нь амиотрофын хажуугийн склероз (ALS) -тай холбоотой супероксид дисмутаза 1 (SOD1) болон Паркинсоны өвчинтэй холбоотой десахараза (PARK7) зэрэг мэдрэлийн дегенератив өвчинтэй холбоотой маркерууд юм. SMOC1 болон тархины баялаг мембраны хавсралт дохионы уураг 1 (BASP1) зэрэг бусад олон маркерууд нь мэдрэлийн доройтолтой өмнөх холбоосыг хязгаарласан болохыг бид мөн баталсан. CSF протеомын нийт элбэг дэлбэг байдлын улмаас MAPT болон бусад зарим AD-тэй холбоотой уурагуудыг (жишээлбэл, NEFL, NRGN) найдвартай илрүүлэхийн тулд энэхүү өндөр хүчин чадалтай нэг удаагийн илрүүлэх аргыг ашиглах нь бидэнд хэцүү гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. ) ( 43, 44).
Дараа нь бид эдгээр 60 тэргүүлэх самбарын тэмдэглэгээг нэмэлт гурван давталттай шинжилгээнд шалгасан. CSF Copy 2-д бид Emory Goizueta ADRC (17)-аас авсан 297 хяналтын болон AD дээжээс бүрдсэн бие даасан когортод дүн шинжилгээ хийхэд нэг TMT-MS ашигласан. CSF репликаци 3 нь Швейцарийн Лозанна хотын 120 хяналтын болон МЭ-тэй өвчтөнүүдийн боломжтой TMT-MS өгөгдлийн дахин шинжилгээг багтаасан (45). Бид өгөгдлийн багц бүр дэх 60 тэргүүлэх тэмдэглэгээний гуравны хоёроос илүүг илрүүлсэн. Хэдийгээр Швейцарийн судалгаанд MS платформууд болон TMT-ийн тоон тодорхойлох аргуудыг ашигласан (45, 46) хэдий ч бид самбарын чиг хандлагыг хоёр удаа давтан хийсэн шинжилгээнд (Зураг 5, C ба D, S2, I, J хүснэгтүүд) хүчтэйгээр хуулбарласан. Манай бүлгийн өвчний өвөрмөц байдлыг үнэлэхийн тулд бид TMT-MS-ийг дөрөв дэх хуулбарлах өгөгдлийн багцыг (CSF репликаци 4) шинжлэхэд ашигласан бөгөөд үүнд зөвхөн хяналтын (n = 18) болон AD (n = 17) тохиолдлууд төдийгүй PD (n = 17) багтсан болно. n = 14)), ALS (n = 18) ба урд цаг хугацааны дементиа (FTD) дээж (n = 11) (Хүснэгт S1A). Бид энэ когорт дахь самбарын уургийн бараг гуравны хоёрыг (60-аас 38) амжилттай тоолж чадсан. Эдгээр үр дүн нь бүх таван биомаркерын самбар дээрх МЭ-ийн өвөрмөц өөрчлөлтийг онцолж байна (Зураг 5E ба Хүснэгт S2K). Метаболитын бүлгийн өсөлт нь AD-ийн хамгийн хүчтэй өвөрмөц байдлыг харуулсан ба дараа нь миелинжилт ба глиал бүлэгт орсон. Бага хэмжээгээр FTD нь эдгээр самбаруудын хоорондох өсөлтийг харуулдаг бөгөөд энэ нь ижил төстэй сүлжээний өөрчлөлтийг тусгаж болно (17). Үүний эсрэгээр, ALS болон PD нь хяналтын бүлгийнхтэй бараг ижил миелинжилт, глиал, метаболомын профайлыг харуулсан. Ерөнхийдөө дээж бэлтгэх, MS платформ болон TMT-ийн тоон тодорхойлох аргуудын ялгааг үл харгалзан эдгээр давтан дүн шинжилгээ нь манай тэргүүлэх самбарын тэмдэглэгээ нь 500 гаруй өвөрмөц CSF дээжинд AD-ийн өвөрмөц өөрчлөлттэй байгааг харуулж байна.
МЭ-ийн мэдрэлийн доройтлыг танин мэдэхүйн шинж тэмдгүүд илрэхээс хэдэн жилийн өмнө өргөнөөр хүлээн зөвшөөрсөн тул AsymAD-ийн биомаркеруудыг яаралтай авах шаардлагатай байна (5, 31). Гэсэн хэдий ч AsymAD-ийн биологи нь нэгэн төрлийн биш гэдгийг улам олон нотолгоо харуулж байгаа бөгөөд эрсдэл ба тэсвэр хатуужлын нарийн төвөгтэй харилцан үйлчлэл нь өвчний дараагийн явц дахь хувь хүний ихээхэн ялгаатай байдалд хүргэдэг (47). Хэдийгээр AsymAD-ийн тохиолдлуудыг тодорхойлоход ашигладаг ч CSF-ийн үндсэн биомаркеруудын түвшин (Aβ1-42, нийт tau ба p-tau) нь хэн ухаангүй болох талаар найдвартай таамаглах боломжгүй (4, 7) нь илүү их байж болохыг харуулж байна. Энэ популяцийн эрсдлийг нарийн тодорхойлохын тулд тархины физиологийн олон тал дээр суурилсан цогц биомаркерын хэрэгслийг оруулах шаардлагатай. Тиймээс бид дараа нь CSF хуулбар 1-ийн AsymAD популяцид AD-аар баталгаажсан биомаркерын самбарт дүн шинжилгээ хийсэн. Эдгээр 31 AsymAD тохиолдол нь үндсэн биомаркерын түвшин (Aβ1–42/нийт ELISA харьцаа, <5.5) болон бүрэн танин мэдэхүйн (MoCA дундаж, 27.1) хэвийн бус байгааг харуулсан. ± 2.2) (Хүснэгт S1A). Нэмж дурдахад, AsymAD-тай бүх хүмүүст эмнэлзүйн дементийн оноо 0 байгаа нь өдөр тутмын танин мэдэхүйн болон функциональ гүйцэтгэл буурсан гэсэн нотолгоо байхгүй байгааг харуулж байна.
Бид эхлээд AsymAD когортыг оруулаад CSF-ийн 96 хуулбар 1-ийн баталгаажуулсан самбаруудын түвшинд дүн шинжилгээ хийсэн. Бид AsymAD бүлгийн хэд хэдэн самбарт AD-тай төстэй элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлтүүд байгааг олж мэдсэн, судасны самбар нь AsymAD-д буурах хандлагатай байсан бол бусад бүх самбарууд өсөх хандлагатай байгааг олж мэдсэн (Зураг 6A). Тиймээс бүх самбарууд ELISA Aβ1-42 болон нийт tau түвшинтэй маш чухал хамааралтай болохыг харуулсан (Зураг 6B). Үүний эсрэгээр, бүлэг болон МоСА онооны хоорондын хамаарал харьцангуй муу байна. Эдгээр шинжилгээний хамгийн гайхалтай олдворуудын нэг бол AsymAD когорт дахь самбарын элбэг дэлбэг байдал юм. Зураг 6А-д үзүүлснээр AsymAD бүлгийн самбарын түвшин нь ихэвчлэн хяналтын бүлэг болон AD бүлгийн самбарын түвшинг давж, харьцангуй өндөр хэлбэлзлийг харуулдаг. AsymAD-ийн энэхүү нэг төрлийн бус байдлыг судлахын тулд бид олон хэмжээст масштабын (MDS) шинжилгээг 96 CSF репликаци 1 тохиолдолд ашигласан. MDS шинжилгээ нь өгөгдлийн багц дахь тодорхой хувьсагч дээр үндэслэн тохиолдлуудын ижил төстэй байдлыг төсөөлөх боломжийг олгодог. Энэхүү кластерийн шинжилгээнд бид зөвхөн CSF-ийн нээлт ба хуулбарлах 1 протеом (n = 29) (Хүснэгт S2L) түвшинд статистикийн ач холбогдолтой өөрчлөлт (P <0.05, AD/control) бүхий баталгаажуулсан самбар тэмдэглэгээг ашигладаг. Энэхүү шинжилгээ нь бидний хяналт болон AD тохиолдлын хооронд тодорхой орон зайн кластерийг бий болгосон (Зураг 6C). Үүний эсрэгээр, зарим AsymAD тохиолдлууд нь хяналтын бүлэгт тодорхой бүлэглэгдсэн байдаг бол зарим нь AD тохиолдлуудад байрладаг. Энэхүү AsymAD-ийн нэг төрлийн бус байдлыг судлахын тулд бид эдгээр AsymAD тохиолдлын хоёр бүлгийг тодорхойлохын тулд MDS газрын зургийг ашигласан. Эхний бүлэгт хяналтад илүү ойртсон AsymAD тохиолдлууд (n = 19) багтсан бол хоёр дахь бүлэг нь AD-тай ойрхон маркерын профайлтай AsymAD тохиолдлуудаар тодорхойлогддог (n = 12).
(A) AsymAD зэрэг CSF хуулбарлах 1 когорт дахь бүх 96 дээж дэх CSF биомаркерын бүлгийн илэрхийллийн түвшин (z-оноо). Самбарын элбэгшлийн өөрчлөлтийн статистик ач холбогдлыг үнэлэхийн тулд Tukey-ийн дараах залруулгатай дисперсийн шинжилгээг ашигласан. (B) ELISA Aβ1-42 болон CSF хуулбар 1 дээж дэх MoCA оноо болон нийт tau түвшинтэй самбарын уургийн элбэг байдлын түвшний (z-оноо) хамаарлын шинжилгээ. Холбогдох P утгатай Pearson корреляцийн коэффициентийг харуулав. (C) CSF хуулбар 1-ийн 96 тохиолдлын MDS нь нээлт болон CSF хуулбар 1 өгөгдлийн багц [P <0.05 AD/control (CT)] хоёуланд нь мэдэгдэхүйц өөрчлөгдсөн 29 баталгаажсан самбар маркерын элбэг байдлын түвшинд үндэслэсэн. Энэхүү шинжилгээг AsymAD бүлгийг хяналтын (n = 19) болон AD (n = 12) дэд бүлгүүдэд хуваахад ашигласан. (D) Галт уулын зураг нь хоёр AsymAD дэд бүлгийн хоорондох -log10 статистик P утгатай харьцуулахад log2 дахин өөрчлөлт (x-тэнхлэг) бүхий CSF репликаци 1-ийн бүх уургийн дифференциал илэрхийлэлийг харуулж байна. Самбарын биомаркерууд өнгөтэй байна. (E) CSF репликаци Сонголтын бүлгийн биомаркерын элбэг дэлбэг байдлын 1 түвшин AsymAD дэд бүлгүүдийн хооронд ялгаатай байдлаар илэрхийлэгддэг. Статистикийн ач холбогдлыг үнэлэхийн тулд Tukey-ийн тохируулсны дараах дисперсийн шинжилгээг ашигласан.
Бид эдгээр хяналтын болон AD-тэй төстэй AsymAD тохиолдлуудын хоорондох уургийн дифференциал илэрхийлэлийг судалж үзсэн (Зураг 6D ба Хүснэгт S2L). Үүссэн галт уулын газрын зураг нь хоёр бүлгийн хооронд 14 самбарын тэмдэглэгээ ихээхэн өөрчлөгдсөн болохыг харуулж байна. Эдгээр маркеруудын ихэнх нь синапс ба метаболомын гишүүд юм. Гэсэн хэдий ч миелин ба глиал дархлааны бүлгийн гишүүд болох SOD1 ба миристолжуулсан аланинаар баялаг уураг киназа С субстрат (MARCKS) нь мөн энэ бүлэгт багтдаг (Зураг 6, D ба E). Судасны самбар нь AD-тэй төстэй AsymAD бүлэгт мэдэгдэхүйц буурсан хоёр маркерыг оруулсан бөгөөд үүнд AE холбогч уураг 1 (AEBP1) болон нэмэлт гэр бүлийн гишүүн С9 орно. ELISA AB1-42 (P = 0.38) ба p-tau (P = 0.28) дахь хяналтын болон AD-тэй төстэй AsymAD дэд бүлгүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаа байхгүй боловч нийт tau түвшинд (P = 0.0031) мэдэгдэхүйц ялгаа байсан. ) (Зураг S7). AsymAD-ийн хоёр дэд бүлгийн хоорондын өөрчлөлт нь нийт tau-ийн түвшнээс (жишээ нь, YWHAZ, SOD1, MDH1) илүү чухал болохыг харуулсан хэд хэдэн самбар тэмдэглэгээ байдаг (Зураг 6E). Ерөнхийдөө эдгээр үр дүн нь бидний баталгаажуулсан самбар нь шинж тэмдэггүй өвчтэй өвчтөнүүдийн эрсдэлийн ангилал, дэд хэв шинжийг ялгах биомаркеруудыг агуулж болохыг харуулж байна.
МЭ-ийн цаадах янз бүрийн эмгэг физиологийг илүү сайн хэмжиж, чиглүүлэхийн тулд системд суурилсан биомаркерын хэрэгслүүд яаралтай хэрэгтэй байна. Эдгээр хэрэгслүүд нь бидний МЭ-ийн оношлогооны тогтолцоог өөрчлөхөөс гадна үр дүнтэй, өвчтөнд тохирсон эмчилгээний стратегийг нэвтрүүлэхэд түлхэц болно (1, 2). Үүний тулд бид тархинд суурилсан эмгэг физиологийн өргөн хүрээг тусгасан вэб-д суурилсан CSF биомаркеруудыг тодорхойлохын тулд AD тархи болон CSF-д шударга бус иж бүрэн протеомик аргыг ашигласан. Бидний шинжилгээгээр CSF-ийн таван биомаркерын хавтанг гаргаж авсан бөгөөд эдгээр нь (i) синапс, цусны судас, миелин, дархлаа болон бодисын солилцооны үйл ажиллагааг тусгасан; (ii) өөр өөр MS платформ дээр хүчтэй давтагдах чадварыг харуулах; (iii) МЭ-ийн эхний болон хожуу үе шатанд өвчний өвөрмөц өөрчлөлтийг харуулах. Ерөнхийдөө эдгээр олдворууд нь МЭ-ийн судалгаа, эмнэлзүйн хэрэглээнд зориулагдсан олон төрлийн, найдвартай, вэбэд чиглэсэн биомаркерын хэрэгслийг хөгжүүлэх ирээдүйтэй алхам юм.
Бидний үр дүн нь МЭ-ийн тархины сүлжээний протеомын өндөр хадгалалттай зохион байгуулалтыг харуулж, түүнийг системд суурилсан биомаркер хөгжүүлэх зангуу болгон ашиглахыг дэмжиж байна. Бидний хийсэн дүн шинжилгээ нь AD болон AsymAD тархи агуулсан бие даасан TMT-MS өгөгдлийн багц нь хүчтэй модульчлагдсан болохыг харуулж байна. Эдгээр олдворууд нь бидний өмнөх ажлыг өргөжүүлж, урд, париетал, түр зуурын бор гадаргын бие даасан олон бүлэгт хамаарах 2000 гаруй тархины эд эсийн хүчирхэг модулиуд хадгалагдаж байгааг харуулж байна (17). Энэхүү зөвшилцлийн сүлжээ нь одоогийн судалгаанд ажиглагдаж буй өвчинтэй холбоотой янз бүрийн өөрчлөлтүүд, тухайлбал глиалаар баялаг үрэвслийн модулиудын өсөлт, нейроноор баялаг модулиудын бууралт зэргийг тусгасан болно. Одоогийн судалгааны нэгэн адил энэхүү том хэмжээний сүлжээ нь AsymAD-д мэдэгдэхүйц модульчлагдсан өөрчлөлтүүдтэй бөгөөд янз бүрийн эмнэлзүйн өмнөх эмгэг физиологийг харуулдаг (17).
Гэсэн хэдий ч энэхүү өндөр консерватив системд суурилсан хүрээнд биологийн ялгаатай байдал, ялангуяа МЭ-ийн эхний үе шатанд байгаа хүмүүсийн дунд илүү нарийн ширхэгтэй байдаг. Манай биомаркерын самбар нь AsymAD-ийн хоёр дэд бүлгийг дүрслэх боломжтой бөгөөд энэ нь олон CSF маркеруудын мэдэгдэхүйц ялгаатай илэрхийлэлийг харуулдаг. Манай бүлэг эдгээр хоёр дэд бүлгийн хоорондох биологийн ялгааг онцолж чадсан бөгөөд энэ нь МЭ-ийн үндсэн биомаркеруудын түвшинд тодорхойгүй байв. Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад эдгээр AsymAD хүмүүсийн Aβ1-42/нийт tau харьцаа хэвийн бус бага байсан. Гэсэн хэдий ч хоёр AsymAD дэд бүлгийн хооронд зөвхөн нийт tau түвшин мэдэгдэхүйц ялгаатай байсан бол Aβ1-42 болон p-tau түвшин харьцангуй харьцангуй хэвээр байв. Өндөр CSF tau нь Aβ1-42 түвшингээс (7) танин мэдэхүйн шинж тэмдгүүдийг илүү сайн урьдчилан таамаглаж байгаа тул AsymAD-ийн хоёр бүлэг өвчний явцын өөр өөр эрсдэлтэй байж магадгүй гэж бид сэжиглэж байна. Манай AsymAD-ийн түүврийн хэмжээ хязгаарлагдмал, уртын дагуу мэдээлэл байхгүй байгаа тул эдгээр дүгнэлтийг итгэлтэйгээр гаргахын тулд нэмэлт судалгаа хийх шаардлагатай байна. Гэсэн хэдий ч эдгээр үр дүн нь системд суурилсан CSF самбар нь өвчний шинж тэмдэггүй үе шатанд хувь хүмүүсийг үр дүнтэй давхаргажуулах чадварыг сайжруулж чадна гэдгийг харуулж байна.
Ерөнхийдөө бидний олдворууд МЭ-ийн эмгэг жам дахь олон биологийн функцүүдийн үүргийг дэмжиж байна. Гэсэн хэдий ч зохицуулалтгүй энергийн солилцоо нь манай бүх баталгаажсан шошгоны таван самбарын гол сэдэв болсон. Гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза 1 (HPRT1) ба лактат дегидрогеназа А (LDHA) зэрэг бодисын солилцооны уураг нь хамгийн баттай батлагдсан синаптик биомаркерууд бөгөөд энэ нь AD CSF-ийн өсөлт нь бэлгийн харьцааны өндөр үржил шимтэй болохыг харуулж байна. Манай цусны судаснууд болон глиал хавтангууд нь исэлдэлтийн бодисын солилцоонд оролцдог хэд хэдэн маркеруудыг агуулдаг. Эдгээр олдворууд нь мэдрэлийн эсүүдийн эрчим хүчний өндөр хэрэгцээг хангахаас гадна астроцит болон бусад глиал эсийн эрчим хүчний өндөр хэрэгцээг хангахын тулд тархины бүхэлдээ бодисын солилцооны үйл явц гүйцэтгэдэг гол үүрэгтэй нийцэж байна (17, 48). Бидний үр дүн исэлдэлтийн потенциалын өөрчлөлт, энергийн зам тасалдал нь митохондрийн эмгэг, глиалаар дамжсан үрэвсэл, судасны гэмтэл зэрэг МЭ-ийн эмгэг жамын хэд хэдэн гол үйл явцын хоорондын гол холбоос байж болохыг нотлох өсөн нэмэгдэж буй нотолгоог дэмжиж байна (49). Нэмж дурдахад, тархи нугасны шингэний бодисын солилцооны биомаркерууд нь бидний хяналт болон AD-тэй төстэй AsymAD дэд бүлгүүдийн хооронд олон тооны ялгаатай баялаг уураг агуулдаг бөгөөд эдгээр энерги болон исэлдэлтийн замуудыг тасалдуулах нь өвчний эмнэлзүйн өмнөх үе шатанд нэн чухал болохыг харуулж байна.
Бидний ажигласан тархи, тархи нугасны шингэний янз бүрийн чиг хандлага нь биологийн сонирхолтой үр дагавартай байдаг. Нейроноор баялаг синапс ба метаболомууд нь AD тархины түвшин буурч, тархи нугасны шингэний элбэг дэлбэг байдлыг харуулдаг. Нейронууд нь олон тооны тусгай дохиог (50) эрчим хүчээр хангахын тулд синапс дахь энерги үүсгэдэг митохондриар баялаг байдаг тул эдгээр хоёр нейроны бүлгийн илэрхийллийн профайл ижил төстэй байх төлөвтэй байна. Мэдрэлийн эсүүд алдагдаж, гэмтсэн эсүүд гадагшлах нь хожуу өвчний тархи болон CSF самбарын эдгээр чиг хандлагыг тайлбарлаж болох боловч бидний ажиглаж буй анхны самбарын өөрчлөлтийг тайлбарлаж чадахгүй (13). Шинж тэмдэггүй өвчний эхэн үеийн эдгээр олдворуудын нэг тайлбар нь хэвийн бус синаптик тайралт юм. Хулганы загваруудын шинэ нотолгоо нь микроглиагаар дамждаг синаптик фагоцитоз нь МЭ-ийн үед хэвийн бус идэвхжиж, тархинд синапс алдагдахад хүргэдэг болохыг харуулж байна (51). Энэ хаягдсан синаптик материал нь CSF-д хуримтлагдаж болох тул бид нейроны самбар дахь CSF нэмэгдэж байгааг ажиглаж байна. Дархлаатай синаптик тайралт нь өвчний явцын туршид тархи, тархи нугасны шингэнд ажиглагддаг глиал уургийн өсөлтийг хэсэгчлэн тайлбарлаж болно. Синаптик тайралтаас гадна экзоцитийн замын ерөнхий гажиг нь мэдрэлийн эсийн маркеруудын тархи болон CSF-ийн янз бүрийн илэрхийлэлд хүргэдэг. Олон тооны судалгаагаар МЭ-ийн тархины эмгэг жам дахь экзосомын агууламж өөрчлөгдсөнийг харуулсан (52). Эсийн гаднах зам нь мөн Aβ-ийн тархалтад оролцдог (53, 54). Экзосомын шүүрлийг дарах нь МЭ-ийн трансген хулганын загварт AD-тэй төстэй эмгэгийг бууруулж болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй (55).
Үүний зэрэгцээ, судасны самбар дахь уураг нь AD тархины дунд зэргийн өсөлтийг харуулсан боловч CSF-д мэдэгдэхүйц буурсан байна. Цус-тархины саад тотгор (BBB) үйл ажиллагааны алдагдал нь эдгээр үр дүнг хэсэгчлэн тайлбарлаж болно. Хүний үхлийн дараах бие даасан олон судалгаагаар МЭ-ийн BBB задралыг харуулсан (56, 57). Эдгээр судалгаанууд нь эндотелийн эсийн нягт битүүмжилсэн давхаргын эргэн тойронд янз бүрийн хэвийн бус үйл ажиллагаа, тухайлбал тархины хялгасан судас гоожих, цусан дахь уургийн судаснуудад хуримтлагдах зэрэг олон янзын хэвийн бус үйл ажиллагаануудыг баталсан байна (57). Энэ нь тархины судасны уургийн өсөлтийг энгийнээр тайлбарлаж болох боловч тархи нугасны шингэн дэх эдгээр уургийн хомсдолыг бүрэн тайлбарлаж чадахгүй. Нэг боломж бол төв мэдрэлийн систем нь үрэвсэл, исэлдэлтийн стресс ихсэх асуудлыг шийдвэрлэхийн тулд эдгээр молекулуудыг идэвхтэй тусгаарлаж байгаа явдал юм. Энэ хэсгийн хамгийн хүнд хэлбэрийн CSF уураг, ялангуяа липопротеины зохицуулалтад оролцдог уургийн бууралт нь үрэвслийн хортой түвшин, реактив хүчилтөрөгчийн төрлүүдийн мэдрэлийн хамгаалалтын үйл явцыг дарангуйлахтай холбоотой юм. Энэ нь цусны эргэлт дэх исэлдэлтийн стрессийн түвшинг бууруулах үүрэгтэй липопротейн холбогч фермент болох пароксоназа 1 (PON1)-ийн хувьд үнэн юм (58, 59). Альфа-1-микроглобулин/бикунины прекурсор (AMBP) нь судасны бүлгийн өөр нэг мэдэгдэхүйц бууралттай маркер юм. Энэ нь липидийн зөөвөрлөгч бикунины урьдал бодис бөгөөд үрэвслийг дарах, мэдрэлийн хамгаалалтад оролцдог (60, 61).
Төрөл бүрийн сонирхолтой таамаглалыг үл харгалзан биохимийн өвчний механизмыг шууд илрүүлэх боломжгүй байгаа нь нээлтэд суурилсан протеомикийн шинжилгээний сайн мэддэг хязгаарлалт юм. Тиймээс эдгээр биомаркер хавтангийн ард байгаа механизмыг итгэлтэйгээр тодорхойлохын тулд цаашдын судалгаа хийх шаардлагатай байна. MS-д суурилсан эмнэлзүйн шинжилгээг хөгжүүлэхийн тулд ирээдүйн чиглэл нь сонгомол эсвэл зэрэгцээ урвалын хяналт гэх мэт томоохон хэмжээний биомаркерын баталгаажуулалтын зорилтот тоон аргуудыг ашиглахыг шаарддаг (62). Бид саяхан энд тайлбарласан CSF уургийн олон өөрчлөлтийг баталгаажуулахын тулд зэрэгцээ урвалын хяналтыг (63) ашигласан. Хэд хэдэн тэргүүлэх зорилтот самбарын зорилтуудыг манай синапс, бодисын солилцоо, үрэвслийн самбартай тус тус харуулдаг YWHAZ, ALDOA, SMOC1 зэрэг ихээхэн нарийвчлалтайгаар тооцдог (63). Бие даасан өгөгдөл олж авах (DIA) болон бусад MS-д суурилсан стратеги нь зорилтот баталгаажуулалтад тустай байж болно. Буд нар. (64) Манай CSF-ийн нээлтийн өгөгдлийн багцад тодорхойлсон МЭ-ийн биомаркерууд болон Европын гурван өөр когортын 200 шахам CSF дээжээс бүрдсэн бие даасан DIA-MS мэдээллийн багцын хооронд ихээхэн давхцаж байгааг саяхан харуулсан. Эдгээр сүүлийн үеийн судалгаанууд нь манай самбаруудыг MS-д суурилсан найдвартай илрүүлэлт болгон хувиргах боломжийг дэмжиж байна. Уламжлалт эсрэгбие ба аптамер дээр суурилсан илрүүлэлт нь МЭ-ийн гол биомаркеруудыг цаашид хөгжүүлэхэд чухал ач холбогдолтой. CSF-ийн элбэг дэлбэг байдлын улмаас эдгээр биомаркеруудыг өндөр хүчин чадалтай MS аргыг ашиглан илрүүлэх нь илүү хэцүү байдаг. NEFL болон NRGN нь бага элбэг байдаг CSF биомаркеруудын хоёр жишээ бөгөөд эдгээрийг манай иж бүрэн шинжилгээнд тусгагдсан боловч манай MS стратеги ашиглан найдвартай илрүүлэх боломжгүй юм. PEA гэх мэт олон эсрэгбиемүүд дээр суурилсан зорилтот стратеги нь эдгээр маркеруудын эмнэлзүйн өөрчлөлтийг дэмжинэ.
Ерөнхийдөө энэхүү судалгаа нь өөр өөр систем дээр суурилсан CSF AD биомаркеруудыг тодорхойлох, баталгаажуулах өвөрмөц протеомик аргыг санал болгож байна. Эдгээр тэмдэглэгээний самбарыг нэмэлт AD бүлэглэлүүд болон MS платформууд дээр оновчтой болгох нь МЭ-ийн эрсдэлийн ангилал, эмчилгээг ахиулах ирээдүйтэй байж магадгүй юм. Эдгээр хавтангийн уртрагийн түвшинг цаг хугацааны явцад үнэлдэг судалгаанууд нь аль маркерын хослол нь өвчний эхэн үеийн эрсдэл болон өвчний хүнд байдлын өөрчлөлтийг хамгийн сайн ангилж болохыг тодорхойлоход чухал ач холбогдолтой юм.
CSF-ээр хуулбарласан 3 дээжээс бусад тохиолдолд энэ судалгаанд ашигласан бүх CSF дээжийг Эмори ADRC эсвэл ойрын холбоотой судалгааны байгууллагуудын ивээл дор цуглуулсан. Эдгээр протеомикийн судалгаанд нийт дөрвөн багц Эмори CSF дээжийг ашигласан. CSF-ийн бүлэгт 20 эрүүл хяналт, 20 МЭ өвчтөний дээж агуулагдаж байсан. CSF хуулбар 1 нь 32 эрүүл хяналт, 31 AsymAD хувь хүн, 33 AD хувь хүний дээжийг агуулдаг. CSF хуулбар 2 нь 147 хяналт, 150 AD дээжийг агуулдаг. Олон өвчний CSF хуулбарлах 4 бүлэгт 18 хяналт, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, 11 FTD дээж багтсан. Эмори Их Сургуулийн Байгууллагын Хяналтын Зөвлөлийн баталсан гэрээний дагуу Эморигийн судалгааны бүх оролцогчид мэдээлэлтэй зөвшөөрөл авсан. 2014 оны Альцгеймерийн төвүүдэд зориулсан Хөгшрөлтийн үндэсний хүрээлэнгийн шилдэг туршлагын удирдамжийн дагуу (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) харцаганы хатгалтаар тархи нугасны шингэнийг цуглуулж, хадгалсан. Хяналтын болон AsymAD болон AD өвчтөнүүд Эмори танин мэдэхүйн мэдрэлийн клиник эсвэл Гойзуэта ADRC-д танин мэдэхүйн стандарт үнэлгээ авсан. Тэдний тархи нугасны шингэний дээжийг INNO-BIA AlzBio3 Luminex-ээр ELISA Aβ1-42, нийт tau болон p-tau шинжилгээнд (65) туршсан. ELISA-ийн утгыг МЭ-ийн биомаркерын тогтоосон хязгаарын шалгуурт үндэслэн субъектуудын оношлогооны ангиллыг дэмжихэд ашигладаг (66, 67). Бусад CSF-ийн оношлогооны (FTD, ALS, PD) хүн ам зүйн болон оношлогооны үндсэн мэдээллийг Эмори ADRC эсвэл харьяа судалгааны байгууллагуудаас авдаг. Эмори CSF-ийн эдгээр тохиолдлын хураангуй мета өгөгдлийг Хүснэгт S1A-аас олж болно. Швейцарийн CSF replication 3 когортын шинж чанаруудыг өмнө нь нийтэлсэн (45).
CSF дээжийг олсон. CSF-ийн мэдээллийн багцыг нээн илрүүлэх гүн гүнзгий байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд трипсинизаци хийхээс өмнө их хэмжээний уургийн дархлааны хэрэглээг хийсэн. Товчхондоо, 40 бие даасан CSF дээжээс 130 мкл CSF болон ижил хэмжээтэй (130 мкл) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) ээрэх баганад (Thermo Fisher Scientific, A89868 өрөөнд) байрлуулсан. температур Өсгөв). 15 минутын турш эргүүлсний дараа дээжийг 1000 г-т 2 минутын турш центрифуг хийнэ. 3K хэт төвөөс зугтах шүүлтүүр төхөөрөмжийг (Millipore, UFC500396) бохир усны дээжийг 14,000 г-т 30 минутын турш центрифугээр баяжуулахад ашигласан. Бүх дээжийг фосфатын буфертэй давсны уусмалаар 75 мкл хүртэл шингэлнэ. Уургийн концентрацийг үйлдвэрлэгчийн протокол (Thermo Fisher Scientific) дагуу bicinchonic acid (BCA) аргаар үнэлэв. Бүх 40 дээжээс авсан дархлаа суларсан CSF (60 мкл) нь лизил эндопептидаза (LysC) болон трипсинээр шингэсэн. Товчхондоо, дээжийг багасгаж, 1.2 мкл 0.5 М трис-2(-карбоксиэтил)-фосфин, 3 мкл 0.8 М хлорацетамидаар 900С-т 10 минутын турш алкилжуулж, дараа нь усан ваннд 15 минутын турш дуу авианы туяанд оруулав. Дээжийг 193 мкл 8 М мочевин буфер [8 М мочевин ба 100 мМ NaHPO4 (рН 8.5)] -аар 6 М мочевин эцсийн концентрацитай болтол шингэлэв. LysC (4.5 мкг; Вако) нь өрөөний температурт шөнийн турш хоол боловсруулахад ашиглагддаг. Дараа нь дээжийг 50 мм аммонийн бикарбонатаар (ABC) 1 М мочевин хүртэл шингэлэв (68). Үүнтэй ижил хэмжээний (4.5 мкг) трипсин (Промега) нэмээд дараа нь дээжийг 12 цагийн турш өсгөвөрлөнө. Задаргаатай пептидийн уусмалыг 1% шоргоолжны хүчил (FA) ба 0.1% трифтор цууны хүчил (TFA) (66) -ийн эцсийн концентраци хүртэл хүчилжүүлж, дээр дурдсанчлан 50 мг Sep-Pak C18 багана (Ус) -аар давсгүйжүүлнэ (25) . Дараа нь пептидийг 1 мл 50% ацетонитрил (ACN) -д шингэлнэ. Уургийн хэмжигдэхүүнийг багцаар (25) стандартчилахын тулд бүх 40 CSF дээжээс 100 мкл аликвотыг нэгтгэн холимог дээжийг үүсгэн, дараа нь дэлхийн дотоод стандарт (GIS) (48) таван дээжинд хуваасан. Бүх бие даасан дээж болон хосолсон стандартыг өндөр хурдны вакуумаар (Лабконко) хатаана.
CSF дээжийг хуулдаг. Дайон болон түүний хамтрагчид өмнө нь CSF-ийн 3 дээжийн (45, 46) хуулбарын дархлаа суларч, задралын талаар тайлбарласан. Үлдсэн хуулбарласан дээжүүд нь тус тусад нь дархлаа сулраагүй. Эдгээр арилгаагүй дээжийг өмнө нь тайлбарласны дагуу трипсинд шингээнэ (17). Дахин шинжилгээ хийх бүрт дээж тус бүрээс ялгарсан пептидийн 120 мкл аликвотыг нэгтгэж, TMT шошготой дэлхийн дотоод стандарт болгон ашиглахын тулд ижил эзэлхүүнтэй хэсгүүдэд хуваасан (48). Бүх бие даасан дээж болон хосолсон стандартыг өндөр хурдны вакуумаар (Лабконко) хатаана. Дээж тус бүрээс 125 мкл-ийг нэгтгэн, бага хэмжээний CSF уургийн дохиог нэмэгдүүлэхийн тулд хуулбарласан шинжилгээ тус бүрт “сайжруулсан” дээж бэлтгэсэн [өөрөөр хэлбэл, судалгааны дээжийг дуурайсан биологийн дээж, гэхдээ бэлэн байгаа хэмжээ нь хамаагүй том (37, 69)] холимог CSF дээжинд нэгтгэгдсэн (17). Холимог дээжийг дараа нь 12 мл High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) ашиглан дархлаа сэргээж, дээр дурдсанчлан шингээж, дараагийн олон TMT шошгонд оруулсан.
Шуудангийн цаг: 2021 оны 8-р сарын 27-ны хооронд