Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй. Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
Термофил бол өндөр температурт үрждэг бичил биетүүд юм. Тэдгээрийг судалснаар амьдрал эрс тэс нөхцөлд хэрхэн дасан зохицдог тухай үнэ цэнэтэй мэдээлэл өгөх боломжтой. Гэсэн хэдий ч ердийн оптик микроскопоор өндөр температурт хүрэхэд хэцүү байдаг. Орон нутгийн эсэргүүцэлтэй цахилгаан халаагуур дээр суурилсан хэд хэдэн гэрийн хийсэн шийдлүүдийг санал болгосон боловч арилжааны энгийн шийдэл байхгүй байна. Энэхүү нийтлэлд бид хэрэглэгчийн орчныг зөөлөн байлгахын зэрэгцээ термофилийн судалгаанд өндөр температур өгөхийн тулд микроскопын харах талбар дээр микро масштабын лазер халаах тухай ойлголтыг танилцуулж байна. Биологийн нийцтэй, үр ашигтай гэрэл шингээгч болох алтны нано бөөмсөөр бүрсэн субстратыг ашиглан дунд зэргийн лазерын эрчимтэй бичил хэмжүүрээр халаах боломжтой. Бичил масштабтай шингэний конвекц, эсийн хадгалалт, төвөөс зугтах термофоретик хөдөлгөөний боломжит үр нөлөөг авч үзсэн. Энэ аргыг хоёр зүйлээр харуулсан: (i) Geobacillus stearothermophilus, 65°С-ийн температурт үрждэг идэвхтэй термофил нян, бидний ажигласнаар бичил хэмжүүрээр халаахад соёолж, ургаж, сэлж байна; (ii) Тиобакилус sp., оновчтой гипертермофиль археа. 80 хэмд. Энэхүү ажил нь орчин үеийн, боломжийн үнэтэй микроскопийн хэрэгслийг ашиглан халуунд тэсвэртэй бичил биетнийг энгийн бөгөөд аюулгүй ажиглах боломжийг нээж өгсөн юм.
Хэдэн тэрбум жилийн турш дэлхий дээрх амьдрал байгаль орчны өргөн хүрээний нөхцөлд дасан зохицохын тулд хувьсан өөрчлөгдөж ирсэн бөгөөд энэ нь бидний хүний үзэл бодлоос заримдаа эрс тэс гэж тооцогддог. Ялангуяа термофил гэж нэрлэгддэг зарим халуунд тэсвэртэй бичил биетүүд (нян, архей, мөөгөнцөр) 45°С-аас 122°C1, 2, 3, 4-ийн температурт үрждэг. Термофилууд далайн гүний усан дулаан суваг, халуун рашаан зэрэг янз бүрийн экосистемд амьдардаг. эсвэл галт уулын бүс нутаг. Тэдний судалгаа сүүлийн хэдэн арван жилийн хугацаанд дор хаяж хоёр шалтгааны улмаас ихээхэн сонирхол татсан. Нэгдүгээрт, бид тэднээс жишээ нь термофиль 5, 6, фермент 7, 8, мембран 9 нь ийм өндөр температурт хэрхэн тогтвортой байдаг, эсвэл термофилууд хэт өндөр цацрагийг хэрхэн тэсвэрлэх чадвартай болохыг мэдэж болно10. Хоёрдугаарт, тэдгээр нь түлш үйлдвэрлэх13,14,15,16, химийн синтез (дигидро, спирт, метан, амин хүчил гэх мэт)17, био олборлолт18, термостат биокатализаторууд7 ,11, зэрэг биотехнологийн олон чухал хэрэглээний үндэс суурь болдог1,11,12, 13. Тодруулбал, одоо мэдэгдэж байгаа полимеразын гинжин урвал (ПГУ)19 нь анхны илэрсэн термофилуудын нэг болох Thermus aquaticus термофиль нянгаас тусгаарлагдсан ферментийг (Taq полимераз) агуулдаг.
Гэсэн хэдий ч термофилийг судлах нь тийм ч амар ажил биш бөгөөд ямар ч биологийн лабораторид үүнийг хийх боломжгүй юм. Ялангуяа амьд термофилийг in vitro ямар ч стандарт гэрлийн микроскопоор ажиглах боломжгүй, тэр ч байтугай худалдаанд гарсан халаалтын камертай, ихэвчлэн 40 хэмээс доош температурт зориулагдсан байдаг. 1990-ээд оноос хойш хэдхэн судалгааны бүлгүүд өндөр температурт микроскоп (HTM) системийг нэвтрүүлэхэд өөрсдийгөө зориулжээ. 1994 онд Глух нар. Халаалтын/хөргөлтийн камер нь агааргүй байдлыг хадгалахын тулд хаалттай тэгш өнцөгт хялгасан судасны температурыг хянадаг Пелтиер эсийн хэрэглээнд тулгуурлан бүтээгдсэн 20 . Төхөөрөмжийг 2 ° C/s хурдтайгаар 100 ° C хүртэл халаах боломжтой бөгөөд зохиогчид Thermotoga maritima21 хэмээх гипертермофил нянгийн хөдөлгөөнийг судлах боломжийг олгодог. 1999 онд Horn et al. Эсийн хуваагдал/холболтыг судлахын тулд арилжааны микроскопод тохиромжтой халсан хялгасан судсыг ашиглахад үндэслэсэн маш төстэй төхөөрөмжийг бүтээжээ. Удаан хугацааны туршид харьцангуй идэвхгүй байсны дараа үр дүнтэй HTM-ийн эрэл хайгуул 2012 онд, ялангуяа Хорн нар зохион бүтээсэн төхөөрөмжийг ашигласан Вирт бүлгийн цуврал нийтлэлтэй холбогдуулан дахин эхэлсэн. 15 жилийн өмнө халсан хялгасан судсыг ашиглан олон тооны архей, түүний дотор гипертермофилийн хөдөлгөөнийг 100 ° C хүртэл температурт судалж байсан23,24. Тэд мөн анхны микроскопыг илүү хурдан халаахын тулд (заавал тогтоосон температурт хүрэхийн тулд 35 минутын оронд хэдэн минут зарцуулдаг) өөрчлөлт хийж, орчны температурын шугаман градиентийг 2 см-ээс илүү болгожээ. Энэхүү температурын градиент хэлбэржүүлэх төхөөрөмжийг (TGFD) биологийн хамааралтай зайд температурын градиент доторх олон термофилуудын хөдөлгөөнийг судлахад ашигласан 24, 25 .
Хаалттай хялгасан судсыг халаах нь амьд термофилийг ажиглах цорын ганц арга биш юм. 2012 онд Кувабара нар. Халуунд тэсвэртэй цавуугаар (Super X2; Cemedine, Япон) битүүмжилсэн гар хийцийн нэг удаагийн Pyrex камерыг ашигласан. Дээжийг 110°С хүртэл халаах чадвартай, гэхдээ анх био дүрслэлд зориулагдаагүй, худалдаанд гарсан ил тод халаалтын хавтан (Micro Heat Plate, Китазато корпораци, Япон) дээр байрлуулсан. Зохиогчид 65 хэмд агааргүй термофиль бактери (Thermosipho globiformans, хоёр дахин нэмэгдэх хугацаа 24 минут) үр дүнтэй хуваагдаж байгааг ажигласан. 2020 онд Пулшен нар. Худалдааны металл тавагны (AttofluorTM, Thermofisher) үр ашигтай халаалтыг таг болон тайз (ПГУ-ын машинаас санаа авсан тохиргоо) гэсэн хоёр гар хийцийн халаалтын элемент ашиглан харуулсан. Энэ холбоо нь шингэний жигд температурыг бий болгож, тагны ёроолд ууршилт, конденсац үүсэхээс сэргийлдэг. O-цагираг ашиглах нь байгаль орчинтой хий солилцохоос зайлсхийдэг. Сульфоскоп гэж нэрлэгддэг энэхүү HTM-г 75°C27 температурт Sulfolobus acidocaldarius-ийн дүрсийг гаргахад ашигласан.
Эдгээр бүх системүүдийн хүлээн зөвшөөрөгдсөн хязгаарлалт нь агаарын зорилгыг ашиглахад хязгаарлалт байсан бөгөөд газрын тосонд дүрэх нь ийм өндөр температурт тохиромжгүй, 1 мм-ээс их зузаантай тунгалаг дээжээр зураг авахад тохиромжгүй байв. Эдгээр бүх системүүдийн хүлээн зөвшөөрөгдсөн хязгаарлалт нь агаарын зорилгыг ашиглахад хязгаарлалт байсан бөгөөд газрын тосонд дүрэх нь ийм өндөр температурт тохиромжгүй, 1 мм-ээс их зузаантай тунгалаг дээжээр зураг авахад тохиромжгүй байв. Общепризнанным недостатком всех этих системы ограничение на воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры болон визуализации через прозрачные мм1 >. Эдгээр бүх системүүдийн хүлээн зөвшөөрөгдсөн дутагдал нь агаарын зорилгыг ашиглахад хязгаарлалт байсан, учир нь газрын тосонд дүрэх нь ийм өндөр температурт тохиромжгүй бөгөөд 1 мм-ээс их зузаантай тунгалаг дээжээр дүрслэхэд тохиромжгүй байв.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适油浸都不适油浸都不适合认限制是限制使用毫米厚的透明样品成像。 Ийм өндөр температурт 1 мм-ээс дээш зузаантай тунгалаг дээжийг ямар ч тосонд дүрэх нь тохиромжгүй байдаг тул эдгээр бүх системийн хүлээн зөвшөөрөгдсөн хязгаарлалт нь агаарт шингэсэн толин тусгалыг ашиглах хязгаарлалт юм. Общепризнанным недостатком бүх төрлийн системүүд нь өндөр температур, визуализаци нь хэт өндөр температур болон визуализацын хэмжээ > мм1 байна. Эдгээр бүх системүүдийн хүлээн зөвшөөрөгдсөн сул тал бол агаарын линзний хязгаарлагдмал хэрэглээ бөгөөд аливаа тосонд дүрэх нь ийм өндөр температурт тохиромжгүй бөгөөд 1 мм-ээс их зузаантай тунгалаг дээжээр дүрслэгддэг.Саяхан Чарльз-Орзаг нар энэхүү хязгаарлалтыг цуцалсан. 28, тэд сонирхож буй системийн эргэн тойронд дулааныг өгөхөө больсон, харин бүрхэвчний шилэн дотор ITO (индиум-цагаан исэл) -ээр хийсэн резисторын нимгэн тунгалаг давхаргаар бүрхэгдсэн төхөөрөмжийг бүтээжээ. Ил тод давхаргаар цахилгаан гүйдэл дамжуулж, тагийг нь 75 ° C хүртэл халааж болно. Гэсэн хэдий ч зохиогч нь линзийг гэмтээхгүйн тулд линзийг объектив хүртэл халаах ёстой, гэхдээ 65 ° C-аас ихгүй байна.
Эдгээр бүтээлүүд нь үр ашигтай өндөр температурт оптик микроскопийг хөгжүүлэх нь өргөн хүрээний хэрэглээгүй, ихэвчлэн гар хийцийн тоног төхөөрөмж шаарддаг, орон зайн нарийвчлалын зардлаар хийгддэг болохыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь дулааны нөлөө бүхий бичил биетүүд цөөхөн хэдэн ширхэгээс илүүгүй байдаг тул ноцтой сул тал юм. микрометр. Халаалтын хэмжээг багасгах нь HTM-ийн төрөлхийн гурван асуудлыг шийдэх гол түлхүүр юм: орон зайн нарийвчлал муу, систем халах үед өндөр дулааны инерци, мөн хэт өндөр температурт хүрээлэн буй элементүүдийг (шивэх тос, объектив линз эсвэл хэрэглэгчийн гар) халах. ).
Энэ нийтлэлд бид эсэргүүцэлтэй халаалт дээр суурилаагүй термофилийн ажиглалтад зориулсан HTM-г танилцуулж байна. Үүний оронд бид гэрэл шингээх субстратыг лазераар цацах замаар микроскопын харах талбайн хязгаарлагдмал бүсэд орон нутгийн халаалтад хүрсэн. Температурын тархалтыг тоон фазын микроскоп (QPM) ашиглан дүрсэлсэн. Энэ аргын үр нөлөөг 65°С-ийн температурт үрждэг хөдөлгөөнт термофил нян Geobacillus stearothermophilus, хоёр дахин үржих хугацаа нь богино (ойролцоогоор 20 минут) ба Sulfolobus shibatae нь 80°C температурт оновчтой ургадаг гипертермофил (archaea)-аар нотлогдсон. дүрслэн харуулах. Хэвийн нөхөн үржихүйн хурд ба усанд сэлэх нь температурын функцээр ажиглагдсан. Энэхүү лазер HTM (LA-HTM) нь бүрхүүлийн зузаан эсвэл зорилгын шинж чанараар (агаар эсвэл тосонд дүрэх) хязгаарлагдахгүй. Энэ нь зах зээл дээрх ямар ч өндөр нарийвчлалтай линзийг ашиглах боломжийг олгодог. Энэ нь мөн дулааны инерцийн улмаас удаан халаалтанд өртдөггүй (миллисекундын хэмжүүрээр шуурхай халаалтад хүрдэг) бөгөөд зөвхөн худалдаанд гарсан бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ашигладаг. Аюулгүй байдлын цорын ганц шинэ асуудал бол төхөөрөмжийн дотор, магадгүй нүдээр дамжих хүчтэй лазер туяа (ихэвчлэн 100 мВт хүртэл) байгаатай холбоотой бөгөөд энэ нь хамгаалалтын шил шаарддаг.
LA-HTM-ийн зарчим нь микроскопын харах талбарт дээжийг орон нутагт халаахын тулд лазерыг ашиглах явдал юм (Зураг 1a). Үүнийг хийхийн тулд дээж нь гэрэл шингээх чадвартай байх ёстой. Лазерын боломжийн хүчийг (100 мВт-аас бага) ашиглахын тулд бид шингэн орчинд гэрлийн шингээлтэд тулгуурлаагүй, харин субстратыг алтан нано хэсгүүдээр бүрэх замаар дээжийн шингээлтийг зохиомлоор нэмэгдүүлсэн (Зураг 1в). Алтны нано бөөмсийг гэрлээр халаах нь биоанагаах ухаан, нанохими эсвэл нарны гэрэл цуглуулах зэрэгт хүлээгдэж буй хэрэглээ болох дулааны плазмоникийн салбарт чухал ач холбогдолтой юм29,30,31. Сүүлийн хэдэн жилийн хугацаанд бид энэ LA-HTM-ийг физик, хими, биологийн дулааны плазмын хэрэглээтэй холбоотой хэд хэдэн судалгаанд ашигласан. Энэ аргын гол бэрхшээл нь температурын эцсийн профайлыг харуулах явдал юм, учир нь өндөр температур нь дээж доторх микро масштабын бүсэд хязгаарлагддаг. Температурын зураглалыг дөрвөн долгионы урттай хөндлөн огтлолын интерферометр, хоёр хэмжээст дифракцийн тор (мөн хөндлөн сараалж гэж нэрлэдэг) ашиглахад суурилсан тоон фазын микроскопийн энгийн, өндөр нарийвчлалтай, маш мэдрэмтгий арга ашиглан хийж болохыг харуулсан. 33,34,35,36. Хөндлөн сараалжтай долгионы фронтын микроскоп (CGM) дээр суурилсан энэхүү дулааны микроскопийн техникийн найдвартай байдлыг сүүлийн 10 жилийн хугацаанд нийтлэгдсэн 37,38,39,40,41,42,43 олон арван нийтлэлд харуулсан.
Зэрэгцээ лазер халаах, хэлбэржүүлэх, температурын микроскоп суурилуулах схем. b Алтны нано бөөмсөөр бүрсэн бүрхүүл агуулсан AttofluorTM камераас бүрдэх дээжийн геометр. c Дээжийг сайтар ажигла (хэмжээгүй). d нь нэг төрлийн лазер туяаны профиль ба (д) алтны нано бөөмсийн дээжийн хавтгай дээрх загварчилсан дараачийн температурын тархалтыг илэрхийлнэ. f нь (g)-д үзүүлсэн температурын тархалтын загварчлалд үзүүлсэн шиг жигд температурыг бий болгоход тохиромжтой дугуй хэлбэртэй лазер туяаны профиль юм. Хэмжээний талбар: 30 микрон.
Ялангуяа бид саяхан хөхтөн амьтдын эсийг LA-HTM болон CGM-ээр халааж, эсийн дулааны цочролын хариу урвалыг 37-42°C-ийн хооронд хянасан нь энэ аргыг нэг амьд эсийн дүрслэлд хэрэглэх боломжтойг харуулсан. Гэсэн хэдий ч LA-HTM-ийг өндөр температурт бичил биетнийг судлахад хэрэглэх нь хоёрдмол утгагүй зүйл биш бөгөөд энэ нь хөхтөн амьтдын эстэй харьцуулахад илүү болгоомжтой байхыг шаарддаг: нэгдүгээрт, орчны ёроолыг хэдэн арван градусаар (хэдэн градусаар биш) халаахад хүргэдэг. хүчтэй босоо температурын налуу руу. шингэний конвекц 44 үүсгэж, хэрэв субстраттай нягт наалдаагүй бол нянгийн хүсээгүй хөдөлгөөн болон холилдоход хүргэдэг. Энэ конвекцийг шингэний давхаргын зузааныг багасгах замаар арилгаж болно. Энэ зорилгоор доор үзүүлсэн бүх туршилтуудад нянгийн суспензийг металл аяганд (AttofluorTM, Thermofisher, Зураг 1b,c) байрлуулсан ойролцоогоор 15 μм зузаантай хоёр бүрхүүлийн хооронд байрлуулсан. Зарчмын хувьд шингэний зузаан нь халаалтын лазерын цацрагийн хэмжээнээс бага байвал конвекцээс зайлсхийх боломжтой. Хоёрдугаарт, ийм хязгаарлагдмал геометрт ажиллах нь аэробик организмыг амьсгал боогдуулж болзошгүй (S2-р зургийг үз). Хүчилтөрөгч (эсвэл бусад амин чухал хий) нэвчих чадвартай субстрат ашиглах, бүрхүүлийн дотор агаарын бөмбөлгийг үлдээх, эсвэл дээд бүрхүүлд цооног өрөмдөх замаар энэ асуудлаас зайлсхийх боломжтой (S1-р зургийг үз) 45 . Энэ судалгаанд бид сүүлчийн шийдлийг сонгосон (Зураг 1b ба S1). Эцэст нь лазер халаалт нь температурын жигд хуваарилалтыг хангаж чадахгүй. Лазерын цацрагийн ижил эрчимтэй байсан ч (Зураг 1d) температурын тархалт жигд биш, харин дулааны тархалтын улмаас Гауссын тархалттай төстэй (Зураг 1e). Зорилго нь биологийн системийг судлахын тулд харах талбайн температурыг нарийн тогтооход чиглэгдсэн бол жигд бус профиль нь тийм ч тохиромжтой биш бөгөөд хэрэв тэдгээр нь субстратад наалдахгүй бол бактерийн термофоретик хөдөлгөөнд хүргэдэг (S3, S4-р зургийг үз)39. Энэ зорилгоор бид орон зайн гэрлийн модулятор (SLM) ашиглан хэт улаан туяаны лазер туяаг дээжийн хавтгай дахь цагирагийн хэлбэрийн дагуу (Зураг 1f) хэлбэржүүлж, өгөгдсөн геометрийн талбайд төгс жигд температурын тархалтыг бий болгосон. дулааны тархалтыг үл харгалзан (Зураг 1d) 39 , 42, 46. Орчуулагчийг ууршуулахгүйн тулд металл таваг дээр (Зураг 1б) дээд нөмрөг хийж, дор хаяж хэдэн өдрийн турш ажигла. Энэ дээд бүрхүүл битүүмжлэгдээгүй тул шаардлагатай бол нэмэлт тэжээлийг хүссэн үедээ хялбархан нэмж болно.
LA-HTM хэрхэн ажилладагийг харуулах, термофилийн судалгаанд ашиглах боломжтойг харуулахын тулд бид 60-65°C орчим өсөлтийн температуртай Geobacillus stearothermophilus аэробик бактерийг судалсан. Бактери нь мөн флагеллатай бөгөөд усанд сэлэх чадвартай бөгөөд эсийн хэвийн үйл ажиллагааны өөр нэг үзүүлэлт юм.
Дээжийг (Зураг 1б) 60°С-т нэг цагийн турш урьдчилан өсгөвөрлөж, дараа нь LA-HTM дээж эзэмшигчид хийсэн. Энэхүү урьдчилсан инкубаци нь сонголттой боловч хоёр шалтгааны улмаас ашиг тустай хэвээр байна: Нэгдүгээрт, лазер асаалттай үед эсүүд нэн даруй ургаж, хуваагдахад хүргэдэг (Нэмэлт материалаас M1 киног үзнэ үү). Урьдчилан инкубаци хийхгүй бол дээж дээр шинэ харах талбайг халаах бүрт нянгийн өсөлт 40 орчим минутаар хойшлогддог. Хоёрдугаарт, 1 цагийн өмнөх инкубаци нь нянгийн бүрхүүлд наалдацыг дэмжиж, лазер асаалттай үед термофорезын улмаас эсүүд харах талбараас гадагш гарахаас сэргийлдэг (Нэмэлт материалаас M2 киног үзнэ үү). Термофорез гэдэг нь температурын градиент дагуух бөөмс эсвэл молекулуудын хөдөлгөөн бөгөөд ихэвчлэн халуунаас хүйтэнд шилжих хөдөлгөөн бөгөөд бактери ч үл хамаарах зүйл биш юм43,47. Энэхүү хүсээгүй нөлөөг лазерын туяаг хэлбэржүүлж, жигд температурын хуваарилалтад хүрэхийн тулд SLM ашиглан тухайн талбайд арилгадаг.
Зураг дээр. 2-р зурагт алтны нано бөөмсөөр бүрсэн шилэн субстратыг цагираг хэлбэрийн лазер туяагаар цацрагаар гаргаж авсан CGM-ээр хэмжсэн температурын тархалтыг харуулав (Зураг 1f). Лазер туяагаар бүрхэгдсэн бүх талбайд температурын тэгш хуваарилалт ажиглагдсан. Энэ бүсийг 65 ° C, өсөлтийн оновчтой температурт тохируулсан. Энэ бүсээс гадна температурын муруй нь байгалийн жамаар \(1/r\) (энд \(r\) нь радиаль координат) хүртэл буурдаг.
Дугуй талбайн хавтгай температурын профайлыг олж авахын тулд алтны нано бөөмсийн давхаргыг цацрагаар цацруулахын тулд цагираг хэлбэрийн лазер туяа ашиглан олж авсан CGM хэмжилтийн температурын зураг. b Температурын зураглалын изотерм (a). Лазер туяаны контурыг саарал өнгийн тасархай тойргоор дүрсэлсэн байна. Туршилтыг хоёр удаа давтан хийсэн (Нэмэлт материал, Зураг S4-ийг үзнэ үү).
Бактерийн эсийн амьдрах чадварыг LA-HTM ашиглан хэдэн цагийн турш хянаж байсан. Зураг дээр. 3-т 3 цаг 20 минутын киноноос авсан дөрвөн зургийн хугацааны интервалыг харуулав (М3 кино, Нэмэлт мэдээлэл). Температур нь хамгийн оновчтой буюу 65°С-д ойртож байсан лазераар тодорхойлсон дугуй талбайд бактери идэвхтэй үржиж байгааг ажиглав. Үүний эсрэгээр, температур 10 секундын турш 50 хэмээс доош унах үед эсийн өсөлт мэдэгдэхүйц буурсан байна.
Лазераар халаасны дараа өөр өөр хугацаанд өсөн нэмэгдэж буй G. stearothermophilus бактерийн оптик гүний зураг, (a) t = 0 мин, (б) 1 цаг 10 минут, (в) 2 цаг 20 минут, (г) 3 цаг 20 минут, (г) 3 цаг 20 минут. 200 Харгалзах температурын зураг дээр байрлуулсан нэг минутын киноноос (Нэмэлт мэдээлэлд өгсөн M3 кино) гаргаж авсан. Лазер нь \(t=0\) үед асна. Изотермуудыг эрчимжүүлсэн зураг дээр нэмсэн.
Цаашид эсийн өсөлт, түүний температураас хамаарлыг тодорхойлохын тулд бид Movie M3 харах талбарт анх тусгаарлагдсан бактерийн янз бүрийн колониудын биомассын өсөлтийг хэмжсэн (Зураг 4). Мини колони үүсгэгч нэгж (mCFU) үүсэх үед сонгосон эх нянгуудыг Зураг S6-д үзүүлэв. Хуурай массын хэмжилтийг температурын тархалтыг зураглахад ашигласан CGM 48 камераар хийсэн. ИНХ-ын хуурай жин ба температурыг хэмжих чадвар нь LA-HTM-ийн хүч чадал юм. Хүлээгдэж буйгаар өндөр температур нь бактерийн өсөлтийг хурдасгахад хүргэдэг (Зураг 4a). 4b-р зурагт үзүүлсэн хагас бүртгэлийн графикаас харахад бүх температурын өсөлт нь экспоненциал өсөлтийг дагаж байгаа бөгөөд өгөгдөл нь экспоненциал функцийг ашигладаг \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), энд \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – үүсгэх хугацаа (эсвэл хоёр дахин нэмэгдэх хугацаа), \( g =1/ \tau\) – өсөлтийн хурд (нэгж цаг тутамд хуваагдах тоо). Зураг дээр. 4c-д температурын хамаарлын дагуу өсөлтийн хурд ба үүсэх хугацааг харуулав. Хурдан өсөн нэмэгдэж буй mCFU нь хоёр цагийн дараа өсөлтийн ханалтаар тодорхойлогддог бөгөөд энэ нь бактерийн өндөр нягтралтай (сонгодог шингэний өсгөвөр дэх суурин үетэй төстэй) хүлээгдэж буй зан үйл юм. Ерөнхий хэлбэр \(g\left(T\right)\) (Зураг 4c) нь G. stearothermophilus-ийн хүлээгдэж буй хоёр фазын муруйтай тохирч, өсөлтийн оновчтой хурд нь 60-65 ° C байна. Өгөгдлийг үндсэн загвар ашиглан тааруулна уу (Зураг S5)49 энд \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, энэ нь уран зохиолд дурдсан бусад утгуудтай сайн тохирч байна49. Температураас хамааралтай параметрүүдийг давтах боломжтой боловч \({G}_{0}\)-ийн өсөлтийн дээд хурд нь нэг туршилтаас нөгөөд өөр байж болно (Зураг S7-S9 болон M4 киног үзнэ үү). Бүх нийтийн байх ёстой температурын тохируулгын параметрүүдээс ялгаатай нь өсөлтийн дээд хурд нь ажиглагдсан микро масштабын геометрийн доторх орчны шинж чанараас (шим тэжээлийн хүртээмж, хүчилтөрөгчийн концентраци) хамаарна.
янз бүрийн температурт бичил биетний өсөлт. mCFU: Бяцхан колони үүсгэх нэгжүүд. Температурын градиентээр ургаж буй нэг нянгийн видео бичлэгээс авсан өгөгдөл (М3 кино). b (a)-тай адил хагас логарифм хуваарь. c Өсөлтийн хурд\(\tau\) ба үүсэх хугацаа\(g\) шугаман регрессийн (b)-аас тооцсон. Хэвтээ алдааны зураас: өсөлтийн явцад mCFU нь харах талбарт өргөжсөн температурын хүрээ. Босоо алдааны мөр: шугаман регрессийн стандарт алдаа.
Хэвийн өсөлтөөс гадна зарим бактери заримдаа лазераар халаах үед гарч ирдэг бөгөөд энэ нь фгелла бүхий бактерийн хүлээгдэж буй зан үйл юм. Нэмэлт мэдээлэл дэх M5 кино нь ийм сэлэлтийн үйл ажиллагааг харуулж байна. Энэ туршилтанд 1d, e, S3 зурагт үзүүлсэн шиг температурын градиент үүсгэхийн тулд жигд лазер цацрагийг ашигласан. Зураг 5-д M5 киноноос сонгогдсон хоёр зургийн дарааллыг харуулсан бөгөөд нэг нян чиглэлтэй хөдөлгөөнийг харуулж байхад бусад бүх бактери хөдөлгөөнгүй хэвээр байна.
Цагийн хоёр хүрээ (a) ба (b) нь тасархай дугуйгаар тэмдэглэгдсэн хоёр өөр бактерийн сэлж байгааг харуулж байна. Зургуудыг M5 киноноос авсан (нэмэлт материал болгон өгсөн).
G. stearothermophilus-ийн хувьд нянгийн идэвхтэй хөдөлгөөн (Зураг 5) лазер туяа асаалтаас хойш хэдхэн секундын дараа эхэлсэн. Энэхүү ажиглалт нь Мора нар аль хэдийн ажиглаж байсанчлан энэ термофиль бичил биетний температурын өсөлтөд түр зуурын хариу үйлдэл үзүүлж байгааг онцолж байна. 24 . Бактерийн хөдөлгөөн, тэр ч байтугай термотаксисын сэдвийг LA-HTM ашиглан цаашид судлах боломжтой.
Микробын усанд сэлэхийг бусад төрлийн биеийн хөдөлгөөнтэй андуурч болохгүй, тухайлбал (i) тодорхой чиглэлгүй эмх замбараагүй хөдөлгөөн мэт харагдах Брауны хөдөлгөөн, (ii) температурын дагуу тогтмол шилжилт хөдөлгөөнөөс бүрдэх конвекц 50 ба термофорез 43. градиент.
G. stearothermophilus нь хамгаалалтын хувьд хүрээлэн буй орчны сөрөг нөлөөнд өртөх үед өндөр тэсвэртэй спор (спор үүсэх) үүсгэх чадвартай гэдгээрээ алдартай. Байгаль орчны нөхцөл байдал дахин таатай болоход спорууд соёолж, амьд эсийг бий болгож, өсөлтийг үргэлжлүүлнэ. Хэдийгээр энэ споржилт/соёололтыг сайн мэддэг ч бодит цаг хугацаанд хэзээ ч ажиглагдаж байгаагүй. LA-HTM ашиглан бид G. stearothermophilus-ийн соёололтыг ажигласан анхны ажиглалтыг энд мэдээлэв.
Зураг дээр. 6а нь 13 спорын CGM багцыг ашиглан олж авсан оптик гүнийн (OT) хурдацтай зургийг харуулж байна. Цуглуулах бүх хугацаанд (15 цаг 6 минут, \(t=0\) – лазераар халаах эхлэл), 13 спорын 4 нь соёолж, дараалсан хугацаанд \(t=2\) цаг, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ба \(11\) h \(30\)'. Эдгээр үйл явдлуудын зөвхөн нэгийг нь Зураг 6-д харуулсан боловч нэмэлт материал дахь M6 киноноос соёололт 4 үйл явдлыг ажиглаж болно. Сонирхолтой нь, соёололт нь санамсаргүй байдлаар харагддаг: хүрээлэн буй орчны нөхцөл ижил өөрчлөлтийг үл харгалзан бүх спорууд соёолж, нэгэн зэрэг соёолдоггүй.
a 8 OT зураг (тосон дүрэлт, 60x, 1.25 NA зорилго) ба (б) G. stearothermophilus агрегатуудын биомассын хувьсалаас бүрдсэн цаг хугацааны хоцрогдол. в (б) Өсөлтийн хурдны шугаман байдлыг тодруулахын тулд хагас логоны масштабаар зурсан (тасархай шугам).
Зураг дээр. 6b,c нь мэдээлэл цуглуулах бүх хугацаанд цаг хугацааны функцээр харах талбар дахь эсийн популяцийн биомассыг харуулав. Зураг дээрх \(t=5\)цагт ажиглагдсан хуурай массын хурдан задрал. 6b, c, зарим нүднүүдийн харагдах талбараас гарсантай холбоотой. Эдгээр дөрвөн үйл явдлын өсөлтийн хурд нь \(0.77\pm 0.1\) h-1 байна. Энэ үзүүлэлт нь эсүүд хэвийн ургадаг Зураг 3. 3 ба 4-тэй холбоотой өсөлтийн хурдаас өндөр байна. Споруудаас G. stearothermophilus-ийн өсөлтийн хурд нэмэгдэж байгаа шалтгаан нь тодорхойгүй байгаа боловч эдгээр хэмжилтүүд нь LA-HTM-ийн сонирхлыг онцолж, эсийн амьдралын динамикийн талаар илүү ихийг мэдэхийн тулд нэг эсийн түвшинд (эсвэл нэг mCFU түвшинд) ажилладаг. .
LA-HTM-ийн олон талт байдал, өндөр температурт түүний гүйцэтгэлийг цаашид харуулахын тулд бид 80°C51 өсөлтийн оновчтой температур бүхий гипертермофилик ацидофилик археа болох Sulfolobus shibatae-ийн өсөлтийг судалсан. G. stearothermophilus-тай харьцуулахад эдгээр архей нь сунасан саваа (нян) гэхээсээ илүү 1 микрон хэмжээтэй бөмбөрцөг (кокк) -той төстэй, маш өөр морфологитой байдаг.
Зураг 7а нь CGM ашиглан олж авсан S. shibatae mCFU-ийн дараалсан оптик гүн зургуудаас бүрдэнэ (Нэмэлт материалаас M7 уран сайхны киног үзнэ үү). Энэ mCFU нь 73°C орчимд, 80°C-ийн оновчтой температураас доогуур, гэхдээ идэвхтэй өсөлтийн температурын хязгаарт ургадаг. Хэдэн цагийн дараа mCFU-г археагийн бичил усан үзэм шиг харагдуулах олон задралын үйл явдлыг бид ажигласан. Эдгээр OT зургуудаас mCFU биомассыг цаг хугацааны явцад хэмжиж, Зураг 7б-д үзүүлэв. Сонирхолтой нь, S. shibatae mCFUs нь G. stearothermophilus mCFU-д ажиглагдсан экспоненциал өсөлтөөс илүү шугаман өсөлтийг харуулсан. Эсийн өсөлтийн хурдны мөн чанарын талаар 52 удаан үргэлжилсэн хэлэлцүүлэг байсаар ирсэн: зарим судалгаагаар микробын өсөлтийн хурд хэмжээ хэмжээтэй (экспоненциал өсөлт) пропорциональ байдаг бол зарим нь тогтмол хурдтай байдаг (шугаман эсвэл хоёр шугаман өсөлт). Tzur et al.53-ын тайлбарласнаар экспоненциал болон (би) шугаман өсөлтийг ялгахын тулд биомассын хэмжилтийн <6%-ийн нарийвчлалыг шаарддаг бөгөөд энэ нь интерферометрийг оролцуулсан ч QPM-ийн ихэнх техникт хүрдэггүй. Tzur et al.53-ын тайлбарласнаар экспоненциал болон (би) шугаман өсөлтийг ялгахын тулд биомассын хэмжилтийн <6%-ийн нарийвчлалыг шаарддаг бөгөөд энэ нь интерферометрийг оролцуулсан ч QPM-ийн ихэнх техникт хүрдэггүй. Цур ба др.53-ыг танилцуулж, биомассын <6% -ийг ялгаж салгах боломжтой, QPM-ийн илүү сайн аргуудыг ашиглах боломжгүй, интерферометрийг ашиглах боломжтой. Zur болон бусад.53-ын тайлбарласнаар экспоненциал болон (би) шугаман өсөлтийг ялгахын тулд биомассын хэмжилтийн <6%-ийн нарийвчлалыг шаарддаг бөгөөд энэ нь интерферометрийг ашигласан ч QPM-ийн ихэнх аргуудын хувьд боломжгүй юм.Зур болон бусад хүмүүсийн тайлбарласнаар. 53, экспоненциал болон (би) шугаман өсөлтийг ялгахын тулд биомассын хэмжилтийн 6% -иас бага нарийвчлал шаардагддаг бөгөөд энэ нь интерферометрийг ашигласан ч QPM-ийн ихэнх аргуудын хувьд боломжгүй юм. CGM нь биомассын хэмжилтэнд sub-pg нарийвчлалтайгаар энэ нарийвчлалд хүрдэг36,48.
a 6 OT зураг (тосон живүүлэх, 60x, NA зорилго 1.25) ба (б) CGM-ээр хэмжсэн микро-CFU биомассын хувьсалаас бүрдэх цаг хугацааны хоцрогдол. Дэлгэрэнгүй мэдээллийг M7 киноноос үзнэ үү.
S. shibatae-ийн төгс шугаман өсөлт нь гэнэтийн байсан бөгөөд хараахан мэдэгдээгүй байна. Гэсэн хэдий ч цаг хугацаа өнгөрөхөд 2, 4, 8, 16 ... эсийн олон хуваагдал үүсэх ёстой тул экспоненциал өсөлтийг хүлээж байна. Эсийн нягтрал хэт өндөр байх үед эсийн өсөлт удааширч, эцэст нь унтаа байдалд хүрдэг шиг шугаман өсөлт нь эсийн нягтралаас болж эсийн дарангуйллаас үүдэлтэй байж магадгүй гэж бид таамагласан.
Халаалтын эзэлхүүнийг багасгах, дулааны инерцийн бууралт, алтны нано бөөмсийг сонирхох, тоон фазын микроскопийг сонирхох, LA-HTM ашиглах боломжтой температурын хязгаар зэрэг таван сонирхолтой зүйлийг бид ээлжлэн ярилцаж дуусгалаа.
Эсэргүүцэлтэй халаалттай харьцуулахад HTM-г хөгжүүлэхэд ашигладаг лазер халаалт нь хэд хэдэн давуу талтай бөгөөд бид энэ судалгаанд харуулсан. Ялангуяа микроскопын харах талбар дахь шингэн орчинд халаах хэмжээг хэдхэн (10 мкм) 3 эзэлхүүнтэй байлгадаг. Ийм байдлаар зөвхөн ажиглагдсан микробууд идэвхтэй байдаг бол бусад бактери идэвхгүй байдаг бөгөөд дээжийг цаашид судлахад ашиглаж болно - шинэ температурыг шалгах бүрт дээжийг өөрчлөх шаардлагагүй болно. Нэмж дурдахад микро масштабаар халаах нь олон төрлийн температурыг шууд шалгах боломжийг олгодог: Зураг 4c-ийг 3 цагийн киноноос (Movie M3) авсан бөгөөд энэ нь ихэвчлэн хэд хэдэн дээж бэлтгэх, шалгах шаардлагатай байдаг - судалж буй дээж тус бүрээс нэг. y нь туршилтын өдрийн тоог илэрхийлэх температур юм. Халсан эзэлхүүнийг багасгах нь микроскопын эргэн тойрон дахь бүх оптик бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг, ялангуяа объектив линзийг өрөөний температурт байлгадаг бөгөөд энэ нь өнөөг хүртэл нийгэмд тулгараад байгаа томоохон асуудал болоод байна. LA-HTM-ийг ямар ч линз, тэр дундаа тосонд дүрэх линзтэй хамт хэрэглэж болох бөгөөд харааны талбарт хэт өндөр температурт ч өрөөний температурт үлдэнэ. Энэхүү судалгаанд бидний мэдээлсэн лазераар халаах аргын гол хязгаарлалт нь наалддаггүй эсвэл хөвдөг эсүүд нь харах талбараас хол, судлахад хэцүү байдаг явдал юм. Хэдэн зуун микроноос илүү температурын өсөлтөд хүрэхийн тулд бага томруулдаг линз ашиглах нь тойрон гарах арга зам байж болох юм. Энэхүү сэрэмжлүүлэг нь орон зайн нарийвчлалын бууралт дагалддаг боловч хэрэв зорилго нь бичил биетний хөдөлгөөнийг судлах юм бол орон зайн өндөр нарийвчлал шаардагдахгүй.
Системийг халаах (болон хөргөх) цагийн хуваарь \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) нь түүний хэмжээнээс хамаарна. хуулийн дагуу \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), энд \ (L\ ) нь дулааны эх үүсвэрийн шинж чанарын хэмжээ (бидний судалгаагаар лазер туяаны диаметр \(L\ ойролцоогоор 100\) мкм), \(D\) нь орчны дулааны тархалт (манайх дундаж) юм. хайрцаг, шил ба ус Тархалтын хурд\(D\ ойролцоогоор 2\ дахин {10}^{-7}\) м2/с). Температурын өсөлтийг агшин зуур тогтоох нь туршилтын үргэлжлэх хугацааг богиносгохоос гадна температурын нөлөөллийн динамик судалгаанд \(t=0\) цагийг нарийн тогтоох боломжийг олгодог.
Бидний санал болгож буй арга нь ямар ч гэрэл шингээх субстратад (жишээлбэл, ITO бүрээстэй арилжааны дээж) хамаарна. Гэсэн хэдий ч алтны нано хэсгүүд нь хэт улаан туяанд өндөр, харагдахуйц мужид бага шингээлт өгөх чадвартай бөгөөд сүүлийн шинж чанарууд нь харагдахуйц мужид үр дүнтэй оптик ажиглалт хийхэд, ялангуяа флюресценцийг ашиглахад сонирхолтой байдаг. Түүнчлэн алт нь био нийцтэй, химийн хувьд идэвхгүй, оптик нягтыг 530 нм-ээс хэт улаан туяаны долгион хүртэл тохируулах боломжтой, дээж бэлтгэх нь энгийн бөгөөд хэмнэлттэй29.
Хөндлөн сараалжтай долгионы микроскоп (CGM) нь зөвхөн микро масштабаар температурын зураглал хийхээс гадна биомассыг хянах боломжийг олгодог бөгөөд үүнийг LA-HTM-тэй хослуулан хэрэглэхэд онцгой ач холбогдолтой (шаардлагагүй бол) болгодог. Сүүлийн 10 жилийн хугацаанд бусад температурын микроскопийн арга техникүүд, ялангуяа био дүрслэлийн салбарт бий болсон бөгөөд тэдгээрийн ихэнх нь температурт мэдрэмтгий флюресцент датчик ашиглахыг шаарддаг54,55. Гэсэн хэдий ч эдгээр аргуудыг шүүмжилж, зарим тайланд эс доторх температурын бодит бус өөрчлөлтийг хэмжсэн нь флюресцент нь температураас бусад олон хүчин зүйлээс хамаардагтай холбоотой байж магадгүй юм. Үүнээс гадна ихэнх флюресцент датчик нь өндөр температурт тогтворгүй байдаг. Тиймээс QPM, ялангуяа CGM нь оптик микроскоп ашиглан өндөр температурт амьдралыг судлах хамгийн тохиромжтой температурын микроскопийн арга юм.
80°С-ийн температурт хамгийн оновчтой амьдардаг S.shibatae-ийн судалгаагаар LA-HTM-ийг энгийн термофилийг бус гипертермофилийг судлахад ашиглаж болно. Зарчмын хувьд, LA-HTM ашиглан хүрч болох температурын хязгаарт хязгаар байхгүй, тэр ч байтугай 100 ° C-аас дээш температурт хүртэл буцалгахгүйгээр атмосферийн даралтад хүрч болно гэдгийг манай 38-ын бүлэг агаар мандлын гидротермаль химийн хэрэглээнд харуулсан. даралт A. Лазерыг алтны нано бөөмс 40-ийг ижил аргаар халаахад ашигладаг. Тиймээс LA-HTM нь стандарт нөхцөлд (жишээ нь хүрээлэн буй орчны стресс) стандарт өндөр нарийвчлалтай оптик микроскопоор урьд өмнө байгаагүй гипертермофилуудыг ажиглахад ашиглах боломжтой юм.
Бүх туршилтыг Köhler гэрэлтүүлэг (LED, M625L3, Thorlabs, 700 мВт), гарын авлагын xy хөдөлгөөнтэй сорьц эзэмшигч, зорилго (Olympus, 60x, 0.7 NA, агаар, LUCPlanFLN60X эсвэл 60x, NA1il) зэрэг гар хийцийн микроскоп ашиглан хийсэн. , UPLFLN60XOI), CGM камер (QLSI хөндлөн сараалжтай, 39 μм-ийн давирхай, Andor Zyla камерын мэдрэгчээс 0.87 мм) эрч хүч, долгионы фронтын дүрслэлийг хангах, мөн sCMOS камер (ORCA Flash 4.0 V3, 16 битийн горим, Hamamatsu-аас) 5-р зурагт үзүүлсэн өгөгдөл (нянгийн сэлэлт). Дикроик цацраг задлагч нь 749 нм BrightLine ирмэг (Semrock, FF749-SDi01) юм. Камерын урд талын шүүлтүүр нь 694 богино дамжуулалтын шүүлтүүр (FF02-694/SP-25, Semrock). Титан индранил лазер (Лазер Верди G10, 532 нм, 10 Вт, шахагдсан цунами лазерын хөндий, 2-5-р зурагт Spectra-Physics, цаашид Millenia лазераар сольсон, Spectraphysics 10 W, шахдаг Мира лазерын хөндий, Coherent, Зураг 2. -5). 6 ба 7) долгионы уртыг \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) нм гэж тохируулсан бөгөөд энэ нь алтны нано бөөмсийн плазмоны резонансын спектртэй тохирч байна. Орон зайн гэрлийн модуляторууд (1920 × 1152 пиксел) Meadowlark Optics-ээс худалдаж авсан бөгөөд 39-р холбоос дээр тайлбарласны дагуу голограммуудыг тооцоолсон.
Хөндлөн сараалжтай долгионы фронтын микроскоп (CGM) нь ердийн камерын мэдрэгчээс нэг миллиметрийн зайд байрлах хоёр хэмжээст дифракцийн торыг (мөн хөндлөн сараалж гэж нэрлэдэг) нэгтгэхэд суурилсан оптик микроскопийн арга юм. Бидний энэ судалгаанд ашигласан ИНХ-ийн хамгийн түгээмэл жишээ бол дөрвөн долгионы урттай хөндлөн шилжилтийн интерферометр (QLSI) гэж нэрлэгддэг бөгөөд хөндлөн сараалж нь Primot нар нэвтрүүлж, патентжуулсан эрчим/фазын даамын самбараас бүрддэг. 200034. Босоо болон хэвтээ сараалжтай шугамууд нь мэдрэгч дээр тортой төстэй сүүдэр үүсгэдэг бөгөөд тэдгээрийн гажуудлыг бодит цаг хугацаанд тоон аргаар боловсруулж, туссан гэрлийн долгионы оптик гажуудлыг (эсвэл түүнтэй адилтгах фазын профайлыг) олж авах боломжтой. Микроскоп дээр ашиглах үед CGM камер нь дүрслэгдсэн объектын оптик замын ялгааг оптик гүн (OT) гэж нэрлэдэг ба нанометрийн дарааллын мэдрэмжтэй харуулж чадна36. Аливаа ИНХ-ын хэмжилтийн хувьд оптик бүрэлдэхүүн хэсэг эсвэл цацрагийн аливаа согогийг арилгахын тулд үндсэн лавлагааны OT дүрсийг авч, дараагийн зургуудаас хасах шаардлагатай.
Температурын микроскопийг лавлагаанд тайлбарласны дагуу CGM камер ашиглан хийсэн. 32. Товчхондоо шингэнийг халаах нь хугарлын илтгэгчийг өөрчилдөг бөгөөд дулааны линзний нөлөөг бий болгож, туссан цацрагийг гажуудуулдаг. Энэхүү долгионы фронтын гажуудлыг CGM-ээр хэмжиж, задралын алгоритмыг ашиглан шингэн орчинд гурван хэмжээст температурын хуваарилалтыг олж авдаг. Хэрэв алтны нано хэсгүүд нь дээжинд жигд тархсан бол температурын зураглалыг нян агуулаагүй газарт хийж, илүү сайн зураг гаргах боломжтой бөгөөд үүнийг бид заримдаа хийдэг. Жишиг CGM дүрсийг халаахгүйгээр (лазер унтраалттай) авсан бөгөөд дараа нь лазер асаалттай зургийн ижил байрлалаас авсан.
Хуурай массын хэмжилтийг температурын дүрслэлд ашигладаг ижил CGM камер ашиглан хийдэг. Нянгийн агууламжаас шалтгаалсан ОТ-д нэгэн төрлийн бус байдлыг дундажлах хэрэгсэл болгон өртөлтийн явцад дээжийг х, у-д хурдан шилжүүлснээр ИНХ-ын лавлагааны зургийг авсан. Бактерийн OT зурагнаас тэдгээрийн биомассыг Матлаб-ын гар хийцийн сегментчиллийн алгоритмыг ашиглан ("Тоон код" дэд хэсгийг үзнэ үү) сонгосон талбайн дээрх зургийн цуглуулга ашиглан авсан. 48. Товчхондоо бид \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} хамаарлыг ашигладаг. } x{{\mbox{d}}}y\), энд \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) нь оптик гүнийн зураг, \(m\) нь хуурай жин ба \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) тогтмол байна. Бид амьд эсийн ердийн тогтмол болох \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) μm3/pg-ийг сонгосон.
25 мм диаметртэй, 150 μм зузаантай алтны нано бөөмсөөр бүрсэн бүрхүүлийг AttofluorTM камерт (Thermofisher) алтны нано хэсгүүдийг дээш харуулан байрлуулсан. Туршилтын өдөр бүрийн өмнө Geobacillus stearothermophilus-ийг LB орчинд (200 rpm, 60 ° C) нэг шөнийн турш урьдчилан өсгөвөрлөсөн. 0.3-аас 0.5 хүртэлх оптик нягттай (OD) G. stearothermophilus-ийн суспензийн 5 мкл дуслыг алтны нано бөөмс бүхий таглаа дээр байрлуулсан. Дараа нь голд нь 5 мм диаметртэй нүхтэй 18 мм диаметртэй дугуй хучаасыг дусал дээр буулгаж, ижил оптик нягтралтай 5 мкл бактерийн суспензийг нүхний голд дахин дахин түрхэв. Хавтан дээрх худгийг лавлагаа-д заасан журмын дагуу бэлтгэсэн. 45 (нэмэлт мэдээллийг Нэмэлт мэдээллийг үзнэ үү). Дараа нь шингэний давхаргыг хатаахаас сэргийлж 1 мл LB тэжээлт бодисыг хавтас дээр нэмнэ. Инкубацийн үед орчин ууршихаас сэргийлэхийн тулд сүүлчийн нөмрөгийг Attofluor™ камерын хаалттай таган дээр байрлуулна. Соёололтыг туршихын тулд бид ердийн туршилтын дараа заримдаа дээд бүрхүүлийг бүрхсэн спорыг ашигласан. Үүнтэй төстэй аргыг Sulfolobus shibatae олж авахад ашигласан. Thiobacillus serrata-г 3 өдрийн (200 rpm, 75 ° C) урьдчилсан тариалалт 182 (DSMZ) дунд явуулсан.
Алтны нано хэсгүүдийн дээжийг мицелляр блок сополимер литографийн аргаар бэлтгэсэн. Энэ үйл явцыг Бүлэгт дэлгэрэнгүй тайлбарласан болно. 60. Толуол дахь HAuCl4-тэй сополимерийг холих замаар алтны ионуудыг бүрхсэн мицеллүүдийг нийлэгжүүлсэн. Дараа нь цэвэрлэсэн нөмрөгийг уусмалд дүрж, алтны үрийг авахын тулд бууруулагч бодисыг байлцуулан хэт ягаан туяаны цацрагаар эмчилэв. Эцэст нь алтан үрийг KAuCl4 ба этаноламины усан уусмалаар 16 минутын турш хавчуулснаар ургуулсан ба энэ нь ойрын хэт улаан туяанд бөмбөрцөг бус алтны нано бөөмсийг бараг үечилсэн, маш жигд байрлуулсан байна.
Интерферограммыг OT зураг болгон хөрвүүлэхийн тулд бид холбоос дээр дэлгэрэнгүй тайлбарласны дагуу гар хийцийн алгоритмыг ашигласан. 33 болон дараах нийтийн санд Matlab багц хэлбэрээр ашиглах боломжтой: https://github.com/baffou/CGMprocess. Багц нь бүртгэгдсэн интерферограмм (лавлагаа зургийг оруулаад) болон камерын массивын зайн дээр үндэслэн эрчим ба OT зургийг тооцоолох боломжтой.
Өгөгдсөн температурын профайлыг олж авахын тулд SLM-д ашигласан фазын загварыг тооцоолохын тулд бид өмнө нь боловсруулсан гар хийцийн алгоритмыг 39,42 ашигласан бөгөөд үүнийг дараах олон нийтийн санд байгаа: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Оролт нь хүссэн температурын талбар бөгөөд үүнийг дижитал эсвэл монохром bmp дүрсээр тохируулж болно.
Эсүүдийг сегментчилж, хуурай жинг нь хэмжихийн тулд бид дараах нийтийн мэдээллийн санд нийтлэгдсэн Матлаб алгоритмаа ашигласан: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Зураг бүр дээр хэрэглэгч сонирхож буй бактери эсвэл mCFU дээр дарж, саваа мэдрэмжийг тохируулж, сонголтоо баталгаажуулах ёстой.
Судалгааны дизайны талаар нэмэлт мэдээлэл авахыг хүсвэл энэ нийтлэлтэй холбосон Байгалийн судалгааны тайлангийн хураангуйг үзнэ үү.
Энэхүү судалгааны үр дүнг дэмжих өгөгдлийг зохих хүсэлтийн дагуу холбогдох зохиогчдоос авах боломжтой.
Энэхүү судалгаанд ашигласан эх кодыг Аргачлалын хэсэгт дэлгэрэнгүй тайлбарласан бөгөөд дибаг хийх хувилбаруудыг https://github.com/baffou/ хаягаас SLM_temperatureShaping, CGMprocess, CGM_magicWandSegmentation хаягаас татаж авах боломжтой.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Thermophiles болон тэдгээрийн өргөн хүрээний хэрэглээний талаархи ойлголт. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Thermophiles болон тэдгээрийн өргөн хүрээний хэрэглээний талаархи ойлголт.Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. ба Шарма, АК Термофилуудын тойм, тэдгээрийн өргөн хэрэглээ. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК.Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамл Д., Шарма АК Термофилуудын талаар гүн гүнзгий ойлголт, өргөн хүрээний хэрэглээ.3 Биотехнологи 6, 81 (2016).
Шуудангийн цаг: 2022 оны 9-р сарын 26-ны хооронд